Methoden zur Charakterisierung des Co-Entwicklung von Biofilm und Habitat Heterogenität
Summary
Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.
Abstract
Biofilme sind oberflächengebundenen mikrobiellen Gemeinschaften, die komplexe Strukturen aufweisen und signifikante räumliche Heterogenitäten. Biofilm Entwicklung wird stark von der umgebenden Strömung und Ernährungsumwelt geregelt. Biofilmwachstum steigt auch die Heterogenität der lokalen Mikroumgebung durch die Generierung komplexer Strömungsfelder und Stofftransport Mustern. Um die Entwicklung von Heterogenität in Biofilmen und Wechselwirkungen zwischen Biofilmen und ihre lokalen Mikrolebensraum zu untersuchen, wuchsen wir Mono-Arten Biofilme von Pseudomonas aeruginosa und Zwei-Spezies-Biofilmen von P. aeruginosa und Escherichia coli unter Ernährungs Gradienten in einer mikrofluidischen Flusszelle. Wir stellen ausführliche Protokolle für die Erstellung von Nährstoff Gradienten innerhalb der Flusszelle und zum Züchten und Visualisierung Biofilmentwicklung unter diesen Bedingungen. Wir weisen das Protokolle für eine Reihe von optischen Verfahren, um räumliche Muster in Biofilmstruktur Quantifizierung fließen distriträge über Biofilme und Massentransport um und in Biofilmkolonien. Diese Methoden unterstützen umfassende Untersuchungen der Co-Entwicklung von Biofilm und Habitatheterogenität.
Introduction
Mikroorganismen auf Oberflächen befestigen und bilden Biofilme – Zellaggregate in einer extrazellulären-Polymermatrix 1 umschlossen. Biofilme ganz anders verhalten als einzelne mikrobielle Zellen, da Biofilme dramatische räumliche Heterogenität aus einer Kombination von internen Stofftransportbeschränkungen und räumlichen Veränderungen im Zellstoffwechsel 2,3 resultiert. Sauerstoff und Nährstoffkonzentration drastisch an der Grenzfläche zwischen den Biofilm und die umgebende Flüssigkeit und innerhalb der Biofilm-2 weiter abgereichert erhalten verringern. Räumliche Variationen Biofilm Atmung und Proteinsynthese kann auch als Reaktion auf die lokalisierten Sauerstoff und Nährstoffverfügbarkeit 2 auftreten.
In Gewässern und Boden-Umgebungen, wohnen die meisten Bakterien in Biofilmen. Natürliche Biofilme die wichtigen biogeochemische Prozesse wie Radfahren Kohlenstoff und Stickstoff und reduzierende Metalle 4,5. Klinisch ist die Bildung von Biofilmen responsIVK längere Lungen- und Harnwegsinfektionen 6. Biofilm-assoziierten Infektionen sind sehr problematisch, weil Zellen in Biofilmen im Vergleich zu ihren Pendants Plankton 6 haben extrem hohe Resistenz gegen antimikrobielle Mittel. Da Biofilme sind in verschiedenen Einstellungen wichtig, ist ein wesentlicher Teil der Forschung auf das Verständnis der Umweltfaktoren, die Biofilm-Aktivitäten und die räumliche Heterogenität in Biofilmen und die umliegende Mikroumgebung steuern konzentriert.
Frühere Studien haben festgestellt, dass Biofilmentwicklung wird stark durch eine Reihe von Umweltfaktoren reguliert: Biofilme entwickeln unterschiedliche Morphologien unter unterschiedlichen Strömungsbedingungen; Sauerstoff- und Nährstoffverfügbarkeit Einfluss Biofilm Morphologie; und hydrodynamische Schubspannung wirkt sich auf die Befestigung der planktonischen Zellen auf Oberflächen und die Ablösung von Zellen von Biofilmen 7-9. Darüber hinaus beeinflusst externen Strömungsbedingungen die Lieferung von Substraten into und in Biofilmen 10. Das Wachstum von Biofilmen verändert auch umgebenden physikalischen und chemischen Bedingungen. Beispielsweise führt das Biofilmwachstum zu lokalen Verarmung an Sauerstoff und Nährstoffen, 2; Biofilme akkumulieren anorganischen und organischen Verbindungen aus der Umgebung 11; und Biofilm Cluster umleiten Flusses und Erhöhung der Oberflächenreibung 12,13. Da Biofilme interagieren mit ihrer Umgebung auf sehr komplexe Weise, ist es entscheidend, um gleichzeitig Informationen über die Biofilmeigenschaften und Umgebungsbedingungen, und multidisziplinäre Ansätze müssen verwendet werden, um umfassend zu charakterisieren Biofilm-Umwelt-Interaktionen werden.
Hier stellen wir eine Reihe von integrierten Methoden räumliche Muster in mikrobiellen Wachstums innerhalb mono-Arten und Zwei-Spezies Biofilmen unter einem auferlegten Nahrungs Gradienten zu charakterisieren, und die resultierende Änderung der lokalen chemischen und Flüssigkeitsmikroumgebung zu beobachten. Wir Tannest beschreiben die Verwendung eines kürzlich entwickelten Doppeleinlaß mikrofluidischen Flusszelle, um die Biofilmwachstum unter definierten chemischen Gradienten zu beobachten. Dann zeigen die Verwendung dieser Mikrofluid-Durchflusszelle, um das Wachstum von zwei Arten von Bakterien, Pseudomonas aeruginosa und Escherichia coli, in Biofilmen unter verschiedenen Ernährungsbedingungen beobachten. Wir zeigen, wie in situ Visualisierung von fluoreszierenden Tracers Ausbreitung in Biofilmkolonien verwendet werden, um quantitativ zu erfassen Muster der Stofftransport in Biofilmen werden. Schließlich zeigen wir, wie Mikropartikelverfolgung Geschwindigkeitsmessung unter der konfokalen Mikroskopie durchgeführt wird, kann zur lokalen Strömungsfeld um den wachsenden Biofilmen zu erhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben gezeigt, eine Reihe von Methoden, um drei wichtige Biofilm-Umwelt-Interaktionen zu charakterisieren: Biofilm Reaktion auf chemische Gradienten, Auswirkungen von Biofilmwachstum auf die umliegende Flussmikroumgebung und Biofilm Heterogenität von internen Transportbeschränkungen resultieren.
Wir haben gezeigt, zuerst die Verwendung eines neuartigen Mikrofluid-Durchflusszelle, um eine gut definierte chemische Gradient für Biofilmentwicklung verhängen. Um eine gut definierte chemis…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Matt Parsek an der University of Washington (Seattle, WA) zur Bereitstellung von P. aeruginosa und E. coli-Stämme und Roger Nokes an der University of Canterbury (Neuseeland) für den Zugriff auf Streams Software. Diese Arbeit wurde durch Zuschuss R01AI081983 von den National Institutes of Health, Nationalen Institut für Allergien und Infektionskrankheiten unterstützt. Konfokale Bildgebung wurde an der Northwestern Biological Imaging Facility (BIF) durchgeführt.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Peristaltic Pump | Gilson | Miniplus 3 | Flow cell setup and inoculation |
| PUMP TUBING 0.50MM OVC, Orange/Yellow | Gilson | F117934 | Flow cell setup and inoculation |
| Three-way Stopcock w/ Swivel male Luer lock | Smiths Medical | MX9311L | Flow cell setup and inoculation |
| Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels | ML Solar LLC | Flow cell setup and inoculation | |
| Pyrex Medium Bottle, 1L, GL45 | VWR | 16157-191 | Flow cell setup and inoculation |
| C-FLEX Tubing | Cole-Parmer | 06422-02 | Flow cell setup and inoculation |
| 1 mL TB Syringe | BD | 309659 | Flow cell setup and inoculation |
| Polymer Tubing | IDEX | 1520G | Flow cell setup and inoculation |
| Sterile Intramedic Luer Stub Adapter | Clay Adams | 427564 | Flow cell setup and inoculation |
| PrecisionGlide Needle | BD | 305195 | Flow cell setup and inoculation |
| Spectrophotometer | HACH | Flow cell setup and inoculation | |
| Syringe filters- sterile (0.2 μm) | Fisherbrand | 09-719A | Flow cell setup and inoculation |
| MAXQ Shaker | Thermo Scientific | Flow cell setup and inoculation | |
| Ammonium sulfate | Sigma Aldrich | A4418 | Growth media |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma Aldrich | RES20908-A7 | Growth media |
| Monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P5655 | Growth media |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | Growth media |
| Magnisium chloride | Sigma Aldrich | M8266 | Growth media |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | Growth media |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma Aldrich | C3771 | Growth media |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 215422 | Growth media |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | Growth media |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | 451657 | Growth media |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z0251 | Growth media |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | Growth media |
| Sodium molybdate | Sigma Aldrich | 243655 | Growth media |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Growth media |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | Growth media |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Growth media |
| TCS SP2 Confocal Microscopy | Leica | Fluorescent imaging | |
| SYTO 62 | Life Technology | S11344 | Fluorescent imaging |
| Cy5 | GE Healthcare Life Sciences | PA15100 | Fluorescent imaging |
| Red Fluorescent (580/605) FluoSphere | Life Technology | F-8801 | Fluorescent imaging |
| BioSPA | Packman Lab | Image Processing | |
| ImageJ | NIH | Image Processing | |
| Volocity | PerkinElmer | Image Processing | |
| Streams 2.02 | University of Cantebury | Image Processing |
Riferimenti
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).
- Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability. Appl Environ Microb. 64 (10), 4035-4039 (1998).
- Costerton, J. W., et al. Bacterial Biofilms in Nature and Disease. Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).
- Battin, T. J., Kaplan, L. A., Newbold, J. D., Hansen, C. M. E. Contributions of microbial biofilms to ecosystem processes in stream mesocosms. Nature. 426 (6965), 439-442 (2003).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
- Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure. J Appl Microbiol. 85, 19S-28S (1999).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: An in situ investigation of biofilm rheology. Biotechnol Bioeng. 65 (1), 83-92 (1999).
- Wasche, S., Horn, H., Hempel, D. C. Influence of growth conditions on biofilm development and mass transfer at the bulk/biofilm interface. Water Res. 36 (19), 4775-4784 (2002).
- Stewart, P. S. Mini-review: Convection around biofilms. Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research. 28 (2), 187-198 (2012).
- Flemming, H. C. Sorption sites in biofilms. Water Sci Technol. 32 (8), 27-33 (1995).
- Debeer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z. Liquid Flow in Heterogeneous Biofilms. Biotechnol Bioeng. 44 (5), 636-641 (1994).
- Schultz, M. P., Swain, G. W. The effect of biofilms on turbulent boundary layers. J Fluid Eng-T Asme. 121 (1), 44-51 (1999).
- Song, J. S. L., Au, K. H., Huynh, K. T., Packman, A. I. Biofilm Responses to Smooth Flow Fields and Chemical Gradients in Novel Microfluidic Flow Cells. Biotechnol Bioeng. 111 (3), 597-607 (2014).
- Shrout, J. D., et al. The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation is nutritionally conditional. Mol Microbiol. 62 (5), 1264-1277 (2006).
- Maxworthy, T., Nokes, R. I. Experiments on gravity currents propagating down slopes. Part 1. The release of a fixed volume of heavy fluid from an enclosed lock into an open channel. J Fluid Mech. 584, 433-453 (2007).
- Stewart, P. S. A review of experimental measurements of effective diffusive permeabilities and effective diffusion coefficients in biofilms. Biotechnol Bioeng. 59 (3), 261-272 (1998).
- Schramm, A., De Beer, D., Gieseke, A., Amann, R. Microenvironments and distribution of nitrifying bacteria in a membrane-bound biofilm. Environ Microbiol. 2 (6), 680-686 (2000).
- Santegoeds, C. M., Schramm, A., de Beer, D. Microsensors as a tool to determine chemical microgradients and bacterial activity in wastewater biofilms and flocs. Biodegradation. 9 (3-4), 159-168 (1998).
- Debeer, D., Stoodley, P., Roe, F., Lewandowski, Z. Effects of Biofilm Structures on Oxygen Distribution and Mass-Transport. Biotechnol Bioeng. 43 (11), 1131-1138 (1994).
- Liu, Y., Tay, J. H. The essential role of hydrodynamic shear force in the formation of biofilm and granular sludge. Water Res. 36 (7), 1653-1665 (2002).
- Zhang, W., et al. A Novel Planar Flow Cell for Studies of Biofilm Heterogeneity and Flow-Biofilm Interactions. Biotechnol Bioeng. 108 (11), 2571-2582 (2011).
- Tseng, B. S., et al. The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin. Environ Microbiol. 15 (10), 2865-2878 (2013).
- Debeer, D., Srinivasan, R., Stewart, P. S. Direct Measurement of Chlorine Penetration into Biofilms during Disinfection. Appl Environ Microb. 60 (12), 4339-4344 (1994).
