Методы Характеризуя совместного развития биопленки и Хабитат неоднородности
Summary
Biofilms have complex interactions with their surrounding environment. To comprehensively investigate biofilm-environment interactions, we present here a series of methods to create heterogeneous chemical environment for biofilm development, to quantify local flow velocity, and to analyze mass transport in and around biofilm colonies.
Abstract
Биопленки поверхностно-прикреплен микробные сообщества, которые имеют сложные структуры и производят значительные пространственные неоднородности. Развитие биопленки активно регулируется окружающей потока и питательной среды. Рост биопленки и повышает неоднородность локального окружения путем генерации сложных полей потока растворенного вещества и транспортным системам. Для исследования развития неоднородности в биопленки и взаимодействия между биопленок и их местных микро-среде обитания, мы выросли моно-видовые биопленки синегнойной палочки и двойного видов биопленки в Р. палочки и кишечной палочки под пищевых градиентов в микрофлюидном ячейку. Мы предоставляем подробные протоколы для создания питательных градиенты в ячейкой, и для выращивания и визуализации развитие биопленки в этих условиях. Мы также представляем протоколы для серии оптических методов количественного пространственных структур в составе биопленки, DISTRI потокаменным биопленок и массового транспорта вокруг и внутри биопленки колонии. Эти методы поддерживают комплексные исследования совместного развития биопленки и среды обитания неоднородности.
Introduction
Микроорганизмы придают поверхности и образуют биопленки – клеточных агрегатов, заключенных в внеклеточного полимерной матрице 1. Биопленки ведут себя очень по-разному от отдельных микробных клеток, потому что биопленки иметь драматические пространственной неоднородности в результате сочетания внутренних ограничений растворенного транспорта и пространственных вариаций в клеточном метаболизме 2,3. Концентрации кислорода и питательных веществ резко уменьшается на границе раздела между биопленки и окружающей жидкости и получить дополнительно обедненного пределах в биопленки 2. Пространственные вариации биопленки дыхания и синтеза белка может происходить в ответ на локализованном кислорода и питательных веществ наличии 2.
В водных и почвенных условиях, большинство бактерий обитает в биопленки. Природные биопленки выполняют важные биохимические процессы, включая велосипедные углерод и азот и снижения металлы 4,5. Клинически, формирование биопленки RESPONSмых для длительного легочной и мочевой инфекции 6. Биопленки-ассоциированной инфекции весьма проблематичным, так как клетки в биопленки имеют чрезвычайно высокую устойчивость к противомикробных препаратов по сравнению с их аналогами планктонных 6. Потому что биопленки играют важную роль в различных условиях, значительное количество исследований было сосредоточено на изучении экологических факторов, которые контролируют биопленки деятельности, а также неоднородность в биопленки и окружающей микросреды.
Предыдущие исследования показали, что развитие биопленки сильно регулируется рядом факторов окружающей среды: биопленки развития различных морфологии в различных условиях потока; кислорода и усвояемость питательных веществ влияние биопленки морфология; и напряжение сдвига гидродинамических влияет на прикрепление планктонных клеток к поверхности и отряду из клеток из биопленок 7-9. Кроме того, внешнее состояние потока влияет на доставку субстратов Intо и в биопленки 10. Рост биопленки также изменяет окружающий физические и химические условия. Например, рост биопленки приводит к локальной истощение кислорода и питательных веществ 2; биопленки накапливаются неорганических и органических соединений из окружающей среды 11; и биопленки кластеры отвлечь потока и увеличение поверхности трения 12,13. Потому что биопленки взаимодействовать с их окружающей средой, в очень сложных отношениях, очень важно, чтобы одновременно получить информацию о свойствах биопленки и условий окружающей среды, и междисциплинарные подходы, должны быть использованы, чтобы всесторонне характеризуют биопленки и окружающей средой.
Здесь мы представляем серию комплексных методов для характеристики пространственных структур в микробного роста в моно-видов и биопленки двойного видов, находящихся под навязанной градиента питания, и наблюдать за результатом изменения местного химического и микросреды жидкости. Мы ельул описывают использование недавно разработанной двойного всасывания клетки Микрожидкостных потока наблюдать рост биопленки под четко определенные химические градиенты. Затем мы продемонстрировать использование этого микрожидкостных проточной ячейке, чтобы наблюдать рост двух видов бактерий, синегнойной палочки и кишечной палочки, в биопленки при различных условиях питания. Покажем, как в месте визуализации флуоресцентного распространения примеси в биопленки колонии могут быть использованы для количественной оценки моделей растворенного транспорта в биопленки. Наконец, мы покажем, как микромасштабная отслеживания частиц велосиметрия, проводится под конфокальной микроскопии, могут быть использованы для получения локальным полем потока вокруг растущих биопленок.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы показали, набор методов, чтобы охарактеризовать три важных взаимодействий биопленки среды: биопленки ответ на химических градиентов, эффекты роста биопленки на окружающую микросреду потока, и биопленки неоднородности в результате ограничений внутреннего транспорта.
<p class="jove_conte…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Мэтт Парсек в университете Вашингтона (Сиэтл, Вашингтон) для обеспечения P. палочки и Е. штаммы кишечной палочки и Роджер Нокс из Университета Кентербери (Новая Зеландия) для обеспечения доступа к потокам программного обеспечения. Эта работа была поддержана грантом R01AI081983 из Национальных институтов здравоохранения, Национальный институт аллергии и инфекционных заболеваний. Конфокальной изображения была выполнена в Северо-Западном Биологическая изображениями фонда (БИФ).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Peristaltic Pump | Gilson | Miniplus 3 | Flow cell setup and inoculation |
| PUMP TUBING 0.50MM OVC, Orange/Yellow | Gilson | F117934 | Flow cell setup and inoculation |
| Three-way Stopcock w/ Swivel male Luer lock | Smiths Medical | MX9311L | Flow cell setup and inoculation |
| Sylgard 184 Solar Cell Encapsulation for Making Solar Panels | ML Solar LLC | Flow cell setup and inoculation | |
| Pyrex Medium Bottle, 1L, GL45 | VWR | 16157-191 | Flow cell setup and inoculation |
| C-FLEX Tubing | Cole-Parmer | 06422-02 | Flow cell setup and inoculation |
| 1 mL TB Syringe | BD | 309659 | Flow cell setup and inoculation |
| Polymer Tubing | IDEX | 1520G | Flow cell setup and inoculation |
| Sterile Intramedic Luer Stub Adapter | Clay Adams | 427564 | Flow cell setup and inoculation |
| PrecisionGlide Needle | BD | 305195 | Flow cell setup and inoculation |
| Spectrophotometer | HACH | Flow cell setup and inoculation | |
| Syringe filters- sterile (0.2 μm) | Fisherbrand | 09-719A | Flow cell setup and inoculation |
| MAXQ Shaker | Thermo Scientific | Flow cell setup and inoculation | |
| Ammonium sulfate | Sigma Aldrich | A4418 | Growth media |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma Aldrich | RES20908-A7 | Growth media |
| Monobasic potassium phosphate | Sigma Aldrich | P5655 | Growth media |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | Growth media |
| Magnisium chloride | Sigma Aldrich | M8266 | Growth media |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C5670 | Growth media |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma Aldrich | C3771 | Growth media |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 215422 | Growth media |
| Manganese(II) sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | Growth media |
| Copper(II) sulfate | Sigma Aldrich | 451657 | Growth media |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z0251 | Growth media |
| Cobalt(II) sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | C6768 | Growth media |
| Sodium molybdate | Sigma Aldrich | 243655 | Growth media |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Growth media |
| Dextrose | Sigma Aldrich | D9434 | Growth media |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Growth media |
| TCS SP2 Confocal Microscopy | Leica | Fluorescent imaging | |
| SYTO 62 | Life Technology | S11344 | Fluorescent imaging |
| Cy5 | GE Healthcare Life Sciences | PA15100 | Fluorescent imaging |
| Red Fluorescent (580/605) FluoSphere | Life Technology | F-8801 | Fluorescent imaging |
| BioSPA | Packman Lab | Image Processing | |
| ImageJ | NIH | Image Processing | |
| Volocity | PerkinElmer | Image Processing | |
| Streams 2.02 | University of Cantebury | Image Processing |
Riferimenti
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: From the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
- Stewart, P. S., Franklin, M. J. Physiological heterogeneity in biofilms. Nat Rev Microbiol. 6 (3), 199-210 (2008).
- Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability. Appl Environ Microb. 64 (10), 4035-4039 (1998).
- Costerton, J. W., et al. Bacterial Biofilms in Nature and Disease. Annu Rev Microbiol. 41, 435-464 (1987).
- Battin, T. J., Kaplan, L. A., Newbold, J. D., Hansen, C. M. E. Contributions of microbial biofilms to ecosystem processes in stream mesocosms. Nature. 426 (6965), 439-442 (2003).
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: A common cause of persistent infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
- Stoodley, P., Dodds, I., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Influence of hydrodynamics and nutrients on biofilm structure. J Appl Microbiol. 85, 19S-28S (1999).
- Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. Structural deformation of bacterial biofilms caused by short-term fluctuations in fluid shear: An in situ investigation of biofilm rheology. Biotechnol Bioeng. 65 (1), 83-92 (1999).
- Wasche, S., Horn, H., Hempel, D. C. Influence of growth conditions on biofilm development and mass transfer at the bulk/biofilm interface. Water Res. 36 (19), 4775-4784 (2002).
- Stewart, P. S. Mini-review: Convection around biofilms. Biofouling: The Journal of Bioadhesion and Biofilm Research. 28 (2), 187-198 (2012).
- Flemming, H. C. Sorption sites in biofilms. Water Sci Technol. 32 (8), 27-33 (1995).
- Debeer, D., Stoodley, P., Lewandowski, Z. Liquid Flow in Heterogeneous Biofilms. Biotechnol Bioeng. 44 (5), 636-641 (1994).
- Schultz, M. P., Swain, G. W. The effect of biofilms on turbulent boundary layers. J Fluid Eng-T Asme. 121 (1), 44-51 (1999).
- Song, J. S. L., Au, K. H., Huynh, K. T., Packman, A. I. Biofilm Responses to Smooth Flow Fields and Chemical Gradients in Novel Microfluidic Flow Cells. Biotechnol Bioeng. 111 (3), 597-607 (2014).
- Shrout, J. D., et al. The impact of quorum sensing and swarming motility on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation is nutritionally conditional. Mol Microbiol. 62 (5), 1264-1277 (2006).
- Maxworthy, T., Nokes, R. I. Experiments on gravity currents propagating down slopes. Part 1. The release of a fixed volume of heavy fluid from an enclosed lock into an open channel. J Fluid Mech. 584, 433-453 (2007).
- Stewart, P. S. A review of experimental measurements of effective diffusive permeabilities and effective diffusion coefficients in biofilms. Biotechnol Bioeng. 59 (3), 261-272 (1998).
- Schramm, A., De Beer, D., Gieseke, A., Amann, R. Microenvironments and distribution of nitrifying bacteria in a membrane-bound biofilm. Environ Microbiol. 2 (6), 680-686 (2000).
- Santegoeds, C. M., Schramm, A., de Beer, D. Microsensors as a tool to determine chemical microgradients and bacterial activity in wastewater biofilms and flocs. Biodegradation. 9 (3-4), 159-168 (1998).
- Debeer, D., Stoodley, P., Roe, F., Lewandowski, Z. Effects of Biofilm Structures on Oxygen Distribution and Mass-Transport. Biotechnol Bioeng. 43 (11), 1131-1138 (1994).
- Liu, Y., Tay, J. H. The essential role of hydrodynamic shear force in the formation of biofilm and granular sludge. Water Res. 36 (7), 1653-1665 (2002).
- Zhang, W., et al. A Novel Planar Flow Cell for Studies of Biofilm Heterogeneity and Flow-Biofilm Interactions. Biotechnol Bioeng. 108 (11), 2571-2582 (2011).
- Tseng, B. S., et al. The extracellular matrix protects Pseudomonas aeruginosa biofilms by limiting the penetration of tobramycin. Environ Microbiol. 15 (10), 2865-2878 (2013).
- Debeer, D., Srinivasan, R., Stewart, P. S. Direct Measurement of Chlorine Penetration into Biofilms during Disinfection. Appl Environ Microb. 60 (12), 4339-4344 (1994).
