In vivo Dynamisk av näthinnan microglial Aktivering Under neurodegeneration: Confocal oftalmoskopiska Imaging och Cell morfometri i mus Glaukom

Summary

Mikroglia aktivering och microgliosis är viktiga svar på kronisk neurodegeneration. Här presenterar vi metoder för in vivo långsiktig visualisering av näthinnan CX3CR1-GFP + mikrogliaceller genom konfokal oftalmoskopi, och för tröskel och morfometriska analyser för att identifiera och kvantifiera deras aktivering. Vi följer microglial förändringar under tidiga stadier av åldersrelaterade glaukom.

Abstract

Mikroglia, som är CNS-bosatta neuroimmune celler, förändra deras morfologi och storlek som svar på CNS-skada, byta till ett aktiverat tillstånd med tydliga funktioner och genuttrycksprofilerna. Roller microglial aktivering i hälsa, skada och sjukdom fortfarande ofullständigt känd på grund av deras dynamiska och komplexa reglering som svar på förändringar i deras mikromiljö. Därför är det viktigt att icke-invasivt övervaka och analysera förändringar i microglial aktivering över tiden i den intakta organismen. In vivo studier av microglial aktivering har försenats av tekniska begränsningar att spåra microglial beteende utan att ändra CNS miljön. Detta har varit särskilt utmanande under kronisk neurodegeneration, där långsiktiga förändringar måste spåras. Näthinnan, en CNS organ mottagliga för icke-invasiv levande avbildning, erbjuder ett kraftfullt system för att visualisera och karakterisera dynamiken i mikroglia aktivering under kroniska sjukdomar.

<p class = "jove_content"> Detta protokoll beskriver metoder för långsiktig, in vivo imaging av retinal mikroglia, med hjälp av konfokal ophthalmoscopy (cSLO) och CX3CR1 ^{GFP / +} reporter möss, för att visualisera mikroglia med cellulär upplösning. Dessutom beskriver vi metoder för att kvantifiera månatliga förändringar i cellaktivering och täthet i stora cellgrupper (200-300 celler per näthinnan). Vi bekräftar användningen av Somal område som ett användbart mått för levande spårning av microglial aktivering i näthinnan genom att tillämpa automatiserad tröskel baserade morfometrisk analys av in vivo bilder. Vi använder dessa sökarbilden förvärv och analyserar strategier för att övervaka de dynamiska förändringar i microglial aktivering och microgliosis under tidiga stadier av retinal neurodegeneration i en musmodell för kronisk glaukom. Detta tillvägagångssätt bör vara användbara för att undersöka bidragen från mikroglia till neuronala och axonal nedgång i kroniska sjukdomar i centrala nervsystemet som påverkar näthinnan och synnerven.

Introduction

Mikroglia är neuroimmune celler som uteslutande uppehåller sig i det centrala nervsystemet (CNS) sedan början av embryonal utveckling och under hela vuxenlivet. Utrustad med en komplex repertoar av receptorer, är microglial aktivitet och regional heterogenitet regleras av deras dubbelriktad samspel med grann neuroner, Glia, blod-hjärnbarriären och infiltrerande neuroinflammatoriska celler ^1,2. Basal microglial funktioner bidrar till fysiologiska underhåll och reparationer, eftersom de prov deras territorium för störningar i homeostasis ^3,4. Under CNS-skada eller sjukdom, mikroglia är de första som svarade på neuronala signaler som sedan utlöser övergången till en reaktiv fenotyp, benämnd "aktiverad mikroglia ^2,5-7. Mikroglia aktivering involverar en invecklad cykel av gen- och proteinuttryck, vilka är kopplade till cell soma och processstorleksändring och remodeling ^6-9. Mikroglia aktivering, liksom omfördelning cell ochklustring, kan åtföljas den lokala totala ökningen av antalet celler (benämnda microgliosis). Detta kan bero på celltillväxt och självförnyelse, med eller utan rekrytering av blodbaserade monocyter ^3,4,7,10-14. I ett brett utbud av åldersberoende, kroniska CNS-sjukdomar, ihållande microgliosis och mikroglia aktivering parallell sjukdomsprogression ^15-19. Hur mikroglia inverkan neurodegeneration är fortfarande oklart, främst därför att de spelar både neuroprotektiva och skadliga roller som kan ha olika bidrag till sjukdomsdebut och progression. Live imaging studier som syftar till att förstå kronisk CNS-sjukdom har övervakat microglial beteende i den skadade CNS djurmodeller och människor, och visade att microglial förändringar är detekterbara början på stegen ^15-17,19,20 tidiga sjukdoms. Därför är det viktigt att utveckla metoder för att upptäcka och övervaka microglial aktivering in vivo.

Icke-invasiv deteInsatser av regionala förändringar i hjärnans mikroglia aktivering etablerades som en viktig in vivo indikator på neurodegenerativ sjukdomsprogression, med hjälp av molecular imaging eller bioluminiscens och positronemissionstomografi eller magnetisk resonanstomografi ^18,21,22. Dessa mycket kvantitativa och icke-invasiva molekylär och kärnavbildningsmetoder upptäcka gliosis med regional upplösning. Alternativt har två-fotonen konfokala avbildning i CX3CR1 ^{GFP / +} möss tillät observation av hjärnans mikroglia med cellulär upplösning ^{3,4,9,20,23-28.} Detta begränsar emellertid långsiktigt tillvägagångssätt och upprepad observation av kroniska mikrogliaceller förändringar, med tanke på den potentiella risken för att störa deras beteende genom att även minimalt invasiva hjärnavbildningsförfaranden ^29. Alternativt erbjuder näthinnan optimala förutsättningar för direkt, in vivo visualisering och upprepad övervakning av mikroglia i deras intakt CNS nisch hela åldrande, efter akut skada, ochpotentiellt under kroniska neurodegenerativa sjukdomar. Således har nya studier visat genomförbarheten av högupplösta avbildning av retinala mikroglia uttrycker GFP genom att anpassa konfokala scanning laser ophthalmoscopy (cSLO) bilden levande CX3CR1 ^{GFP / +} möss. Detta har använts för att spåra varje vecka förändringar i GFP + cellantal i individuella möss i upp till 10 veckor efter akut inducerad skada eller okulär hypertension ^30-36.

Vi har utökat denna metod för att utföra långsiktiga avbildning under flera månader, och kvantitativt spåra ändringar i mikroglia aktivering baserat på soma storlek använder morfometrisk analys. Somal storlek definierades som en användbar metriska av mikroglia aktivering i levande imaging studier med två-foton konfokalmikroskopi i kortikala skivor för att utföra in vivo avbildning av CX3CR1-GFP + mikroglia ^9. Dessa och andra studier visade också sambandet mellan Somal storlek och halter av Iba1 proteinuttryck, which ökar också med aktivering ^9,37. Således kan aktiveras mikroglia identifieras i levande möss, och deras antal och distribution övervakas under tiden under CNS hälsa och sjukdom.

Detta protokoll beskriver metoder för cSLO sökarbilden insamling och analys för att övervaka microglial cellantal, distribution och morfologisk aktivering under näthinneganglieceller (RGC) degeneration (Figur 1). Således använder denna studie: 1) en musmodell av ärftlig glaukom (DBA / 2J) som genomgår åldersberoende synnerven och retinal neurodegeneration och visar anmärkningsvärd variation i sjukdomsförloppet mellan 5 och 10 månaders ålder ^38,39, 2) månads cSLO in vivo imaging för långsiktig visualisering av GFP + celler i näthinnan och omyeliniserad synnerven av heterozygota CX3CR1 ^{GFP / +} DBA / 2J möss åldern 3-5 månader, 3) levande bildanalys genom segmentering och tröskel att isolera cell somata och åtgärd denir område. Dessa strategier används för att bedöma kinetiken av näthinnans microglial aktiveringstillstånd under tidiga stadier av kronisk glaukom.

Protocol

In vivo imaging utförs i patogenfria anläggningar som använder protokoll som godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Utah. OBS: Denna avbildning protokollet används för reporter möss i vilka retinala mikroglia och infiltrerande monocyter / makrofager uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) under kontroll av den fraktalkin receptor lokus (CX3CR1). 1. In vivo avbildning av näthinnan GFP + mikroglia av Confocal Scan…

Representative Results

Våra senaste in vivo-studier använt dessa levande bild förvärv och analysmetoder för att visualisera och spåra kinetik och mönster av ONH och retinala microglial förändringar under tidiga stadier av kronisk glaukom och deras förhållande till slutet av neurodegeneration 59. Här visar vi en cSLO bildtagning protokoll för att visualisera mikrogliaceller över ett stort område i den centrala näthinnan i enskilda unga heterozygota CX3CR1-GFP DBA / 2J näthinnor (Figur 5). B…

Discussion

Realtidsövervakning av microglial cellantal och morfologiska aktivering under en neurodegenerativ sjukdom kräver användning av icke-invasiva avbildningsmetoder som tillåter detaljerad visualisering av cellsärdrag. Efter bildbehandling, måste mikrogliaceller isoleras (segmenterad) för morfometrisk analys genom användning av flera tröskel åtgärder för att bedöma Somal storlek och / eller processkomplexitet som avläsningar för mikroglia aktivering. I detta protokoll, beskriver vi metoder för levande bildtag…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DBA/2J and CX3CR1-GFP/+ mice	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME	000671 and 00582	Mice are breed in-house, introducing new breeders every 3 to 4 generations to prevent genetic drift.
301/2G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe	BD, East Rutherford, NJ	305106 and 309659
2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T48402, 152463 and P4417	Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4ºC for up to 1 week.
Heat therapy T/Pump	Gaymar Industries, Orchard Park, NY	TP-650
Cotton-tipped applicators	Fisher Scientific, Pittsburgh, PA	23-400-100
Tropicamide 1%	Bausch & Lomb, Rochester, NY	NDC 24208-585-64
PMMA contact lenses, 1.70-base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm-thick center	Cantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, UK	G003709	Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes.
HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software	Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA	Version 1.7.1.0
PowerPoint	Microsoft, Redmond, WA	Version 14.4.3
Adobe Photoshop	Adobe, San Jose, CA	Version CS3
FluoRender	Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah	Version 2.13	Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html
NIS-Elements C	Nikon, Melville, NY	Version 4.30.01