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Medicine

마우스 녹내장에 공 촛점 안저 이미징 및 세포 형태 계측 : 신경 퇴행 중 망막 미세 아교 활성화의 생체 역학

Published: May 11, 2015
doi:
10.3791/52731
, , ,
1Department of Neurobiology & Anatomy,University of Utah, 2Department of Ophthalmology & Visual Sciences,University of Utah

Summary

미세 아교 세포의 활성화 및 microgliosis 만성 신경 퇴행의 핵심 반응이다. 여기, 우리는 생체 내, 공 초점 검안경으로 망막 CX3CR1-GFP + 미세 아교 세포의 장기 시각화를위한 방법을 제시하고, 임계 값 및 형태 계측 학적 대한 식별과 활성화를 정량화 분석한다. 우리는 연령과 관련된 녹내장의 초기 단계 소교 변경 사항을 모니터링 할 수 있습니다.

Abstract

CNS 상주 신경 면역 세포 인 미세 아교 세포는 별개의 기능 및 유전자 발현 프로파일과 액티브 상태로 전환하는, CNS 손상에 응답하여 자신의 형태와 크기를 변환. 건강, 상해 및 질병에 미세 아교 활성화의 역할은 불완전 인해 미세 환경의 변화에​​ 따라 자신의 역동적이고 복잡한 규정을 이해 남아 있습니다. 이에 따라, 비 침습적으로 모니터에 중요하며, 본래 유기체 경시 소교 활성의 변화를 분석한다. 생체 내에서 활성화를 소교 연구 CNS 환경을 바꾸지 않고 동작 추적 소교 기술적 한계에 의해 지연되어왔다. 이는 장기간 변화 추적해야 만성 신경 퇴화, 특히 도전 중에있다. 망막, 비 침습적 라이브 영상 의무가 중추 기관, 시각화 및 만성 질환 중 미세 아교 세포 활성화의 역학을 특성화 할 수있는 강력한 시스템을 제공합니다.

<p cl엉덩이 = "jove_content">이 프로토콜은 장기간의 망막 미세 아교 세포의 생체 내 이미징, 세포 해상도와 미세 아교 세포를 시각화, 공 촛점 검안경 (cSLO) 및 CX3CR1 GFP / + 기자 마우스를 사용하는 방법을 설명합니다. 또한, 우리는 대 세포 하위 집합의 세포 활성화와 밀도의 월별 변화 (망막 당 200-300 세포)를 정량화하는 방법을 설명합니다. 우리는 생체 화상의 자동 임계 값 기반 형태 계측 분석을 적용하여 망막 미세 아교 활성화의 실시간 추적을 위해 유용한 메트릭으로서 somal 영역의 사용을 확인한다. 우리는이 라이브 화상 취득을 사용 만성 녹내장의 마우스 모델에서 망막 신경 퇴행의 초기 단계에서 미세 아교 활성화 및 microgliosis의 동적 변화를 모니터링하기위한 전략을 분석한다. 이 방법은 망막과 시신경에 영향을 미치는 만성 중추 신경계 질환에서 신경 세포와 축삭 감소에 미세 아교 세포의 기여를 조사하는 데 유용합니다.

Introduction

미세 아교 세포는 독점적으로 초기 배아 발달 이후 성인기에 걸쳐 중추 신경계 (CNS)에있는 신경 면역 세포이다. 수용체의 복잡한 레퍼토리를 장착, 미세 아교 활동 및 지역 이질성이 인접 신경 아교 세포, 혈액 – 뇌 장벽 및 신경 염증성 세포 1,2 침투 자신의 양방향 상호 작용에 의해 조절된다. 그들이 항상성의 3,4의 섭동에 대한 자신의 영토를 샘플로 기저 소교 기능, 생리 유지 보수 및 수리에 기여한다. CNS의 부상 또는 질병 중, 미세 아교 세포는 반응 표현형에 자신의 전환을 트리거 신경 신호의 첫 번째 조치는 "미세 아교 세포 2,5-7 활성화 되나. 미세 아교 세포의 활성화는 세포 소마와 프로세스 크기 조정 및 6-9 리모델링에 연결되는 유전자 및 단백질 발현의 복잡한 사이클을 포함한다. 미세 아교 세포의 활성화뿐만 아니라, 셀 재분배클러스터링은, 셀의 수 (라 microgliosis)에서 로컬 전반적인 증가를 수반 할 수있다. 이것은 또는 혈액 유래 단핵구 3,4,7,10-14 모집없이 세포 증식과 자기 갱신에서 발생할 수 있습니다. 연령 의존적 만성 CNS 질병의 광범위한 범위에서 microgliosis 및 미세 아교 세포 활성화 평행 질병 진행을 유지 15-19. 어떻게 미세 아교 세포 충격 신경 퇴행하는 것은 그들이 질병의 발병과 진행에 다양한 기여를 할 수 있습니다 모두 신경과 해로운 역할을 주로하기 때문에, 확실하지 않다. 만성 중추 신경계 질환을 이해하기위한 라이브 영상 연구는 동물 모델과 인간의 손상된 중추 신경계의 소교 동작을 모니터링하고, 미세 아교 변경이 초기 질병 단계 15-17,19,20에서 검출 시작이라는 것을 증명하고있다. 따라서, 검출 및 생체 내에서 활성화를 소교 모니터링하는 방법을 개발하는 것이 중요하다.

비 침습적 DETE뇌 미세 아교 세포의 활성화에 지역 변경 ction의는 분자 영상 또는 생물 발광 및 양전자 방출 단층 촬영이나 자기 공명 영상 18,21,22를 사용하여, 신경 퇴행성 질병 진행의 생체 지표에 중요한로 설립되었다. 이러한 고도로 정량적 및 비 침습적 분자 핵 촬상 방법은 지역 신경교 증 해상도를 검출한다. 또한, CX3CR1 GFP / + 마우스의 두 광자 공 초점 영상은 세포 해상도 3,4,9,20,23-28와 뇌 미세 아교 세포의 관찰을 허용했다. 그러나이 방법은 심지어 최소 침습 뇌 영상 절차 (29)에 의해 행동을 방해의 잠재적 위험 주어진 장기 만성 소교 변화의 반복 관찰을 제한한다. 또한, 망막 급성 손상 후 생체 내 시각화 직접위한 최적의 조건, 노화에 걸쳐 자신의 본래 중추 신경계의 틈새에서 미세 아교 세포의 반복 모니터링을 제공하며,잠재적으로 만성 신경 퇴행성 질환 중. 따라서, 최근 연구에 촛점 이미지 스캐닝 레이저 검안경 (cSLO) 라이브 CX3CR1 GFP / + 마우스를 적응시킴으로써 GFP를 발현하는 망막 미세 아교 세포의 고해상도 영상의 가능성을 증명했다. 이것은 급성 유도 상해 또는 안구 고혈압 30-36 다음 최대 10 주 동안 개인 마우스의 GFP + 세포 수의 주간 변화를 추적하는 데 사용되었습니다.

우리는 몇 개월 이상 장기 촬상을 수행 한 정량적 형태 계측 분석을 사용하여 소마 크기에 기초하여 미세 아교 세포의 활성의 변화를 추적하기 위해이 방법을 확장 하였다. Somal 크기 CX3CR1-GFP + 9 미세 아교 세포의 생체 내 이미징 수행 피질 슬라이스 개의 광자 공 초점 현미경을 사용하여 실시간 이미징 실험의 미세 아교 세포 활성화의 유용한 메트릭으로 정의 하였다. 이들 및 다른 연구에서도 WH, somal 사이즈 Iba1 단백질 발현 수준 간의 상관 관계를 증명무형 문화 유산도 활성화 9,37 증가한다. 따라서, 활성화 된 미세 아교 세포는 살아있는 마우스에서 확인 될 수 있으며, 그 수 및 분포는 CNS 상태 및 질환의 시간 경과를 모니터링.

이 프로토콜은 cSLO 라이브 이미지 수집 및 분석을위한 방법은 미세 아교 세포 수, 망막 신경절 세포 (RGC) 변성 (그림 1) 동안의 분포와 형태 학적 활성을 모니터링에 대해 설명합니다. 따라서, 본 연구에서는 사용 : 1) 연령에 따라 시신경 및 망막 신경 퇴행 및 겪는 상속 녹내장 (DBA / 2J)의 마우스 모델의 나이 (38, 39)의 5 10개월 사이에서 질병의 진행에 놀라운 변화를 보여주고, 2) 월 장기 망막에 GFP + 세포의 시각화 3-5 개월 세포 인 somata 및 측정을 분리하는 분할 및 임계 3) 라이브 영상 분석 세 이형 Cx3cr1 GFP / + DBA / 2J 마우스의 무수 시신경에 대한 cSLO 생체 내 이미징적외선 영역입니다. 이러한 전략은 만성 녹내장의 초기 단계에서 망막 미세 아교 활성화 상태의 동역학을 평가하기 위해 적용된다.

Protocol

생체 내 이미징은 유타 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜을 사용하여 무균 시설에서 수행된다. 참고 :이 영상 프로토콜은 망막 미세 아교 세포 및 침투 단핵구 / 대 식세포가 fractalkine 수용체 궤적 (CX3CR1)의 통제하에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하는 기자 마우스에 사용됩니다. 공 초점 주사 레이저 검안경으로 망막 GFP + 미세 아교…

Representative Results

우리의 최근 생체 내에서 연구 시각화하고 늦게 신경 퇴행 59 만성 녹내장과의 관계의 초기 단계 반응 속도와 시신경 유두와 망막 미세 아교 변화의 패턴을 추적하는이 라이브 이미지 수집 및 분석 방법을 사용했다. 여기에서 우리는 개인의 젊은 이형 Cx3CR1-GFP의 DBA / 2J 망막의 중심 망막 (그림 5)의 넓은 지역에 걸쳐 미세 아교 세포를 시각화하는 cSLO 영상 획득 프로토콜?…

Discussion

신경 퇴행성 질환 중 소교 세포의 수와 활성 형태의 실시간 모니터링은 세포 기능의 상세한 시각화를 허용 비 침습성 영상화 방법의 사용을 요구한다. 촬상 후, 소교 세포는 미세 아교 세포의 활성화를위한 판독 somal 같은 크기 및 / 또는 공정의 복잡성을 평가하기 위해 여러 단계의 임계치를 이용하여 형태 학적 분석을 위해 (분단) 고립되어야한다. 이 프로토콜에서는, 우리는 cSLO를 사용하여 라이…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank the Scientific Computing and Imaging Institute of the University of Utah for use of FluoRender software (R01GM09815). This work was supported by grants from the Glaucoma Research Foundation, Melsa M. and Frank Theodore Barr Foundation and the US National Institute of Health, (R01EY020878 and R01EY023621) to M.L.V., and (R01EY017182 and R01EY017950) to B.K.A.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DBA/2J and
CX3CR1-GFP/+ mice		 The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME 000671 and 00582 Mice are breed in-house, introducing new breeders every 3 to 4 generations to prevent genetic drift.
301/2G needle and 1 ml tuberculin slip-tip syringe BD, East Rutherford, NJ 305106 and 309659
2,2,2-tribromoethanol, tert-Amyl alcohol 99% and phosphate buffer saline tablets Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T48402, 152463 and P4417 Avertin solution (pH 7.3, sterile filtered) must be freshly made solution or stored at 4ºC for up to 1 week.
Heat therapy T/Pump Gaymar Industries, Orchard Park, NY TP-650
Cotton-tipped applicators Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 23-400-100
Tropicamide 1%  Bausch & Lomb, Rochester, NY NDC 24208-585-64
PMMA contact lenses, 1.70-base curve, 3.2 mm total diameter, 0.40 mm-thick center Cantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, UK G003709 Lenses are rinsed with sterile PBS and stored in polypropylene boxes.
HRA/Spectralis confocal scanning laser ophthalmoscope and Eye Explorer software Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA Version 1.7.1.0
PowerPoint Microsoft, Redmond, WA Version 14.4.3
Adobe Photoshop Adobe, San Jose, CA Version CS3
FluoRender Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah Version 2.13 Freeware. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html
NIS-Elements C Nikon, Melville, NY Version 4.30.01
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Bosco, A., Romero, C. O., Ambati, B. K., Vetter, M. L. In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma. J. Vis. Exp. (99), e52731, doi:10.3791/52731 (2015).
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