Infusão estereotáxica de oligomica beta-amilóide no ratinho Hippocampus
Summary
Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.
Abstract
A doença de Alzheimer é uma doença neurodegenerativa que afecta o envelhecimento da população. Uma característica neuropatológica chave da doença é a sobre-produção de beta-amilóide e a deposição de placas de amilóide-beta em regiões do cérebro dos indivíduos afectados. Ao longo dos anos, os cientistas têm gerado numerosos modelos de rato da doença de Alzheimer que tentam reproduzir a patologia beta-amilóide. Infelizmente, os modelos de ratinho única imitar selectivamente as características da doença. A morte neuronal, um efeito proeminente nos cérebros de pacientes com doença de Alzheimer, é notoriamente ausente nestes ratinhos. Por isso, nós e outros têm utilizado um método de infundir diretamente espécies oligoméricas solúveis de beta-amilóide – Formas de amilóide-beta que têm sido provada a ser mais tóxico para os neurônios – stereotaxically no cérebro. Neste relatório nós utilizamos camundongos C57BL / 6J para documentar esta técnica cirúrgica de aumentar os níveis de beta-amilóide em uma região do cérebro select. Oinfusão alvo é o giro dentado do hipocampo, porque esta estrutura do cérebro, juntamente com o cérebro anterior basal, que é ligado pelo circuito colinérgico, representa uma das áreas de degeneração na doença. Os resultados de elevação beta-amilóide no giro denteado através de infusão estereotáxico revelam aumentos na perda de neurónios no giro dentado no prazo de 1 semana, enquanto existe um aumento concomitante na morte de células e perda de neurónios colinérgicos no membro vertical da banda diagonal de Broca do prosencéfalo basal. Estes efeitos são observados até 2 semanas. Nossos dados sugerem que o atual modelo de infusão de beta-amilóide fornece um modelo alternativo do mouse para abordar a morte dos neurônios específicos região em uma base de curto prazo. A vantagem deste modelo é que a beta-amilóide pode ser elevada de um modo espacial e temporal.
Introduction
Depósitos de placas amilóides, que são compostos de beta-amilóide (Ap 1-42), são um elemento-chave da patologia da doença de Alzheimer (DA). Numerosos estudos têm demonstrado que níveis elevados ou tóxicos de recombinante oligomeric Ap 1-42 provocar a morte neuronal, sináptica distrofia, perda e disfunção; bem como de aprendizagem e memória défices 1-4. Regiões do cérebro afetadas incluem o hipocampo, no córtex e estruturas subcorticais tais como o cérebro anterior basal ea 5,6 amígdala. Até à data, existem vários modelos de camundongos transgênicos que tentam simular o Aâ 1-42 patologia da AD. Dependendo da estirpe estes animais revelar-se útil para examinar seleccione características patológicas da DA. Infelizmente, com a excepção de duas linhas transgénicas, APP23 e 5XFAD, estes ratinhos não replicar completamente a perda neuronal, um aspecto chave da AD. Mesmo com a perda neuronal observada em APP23 e 5XFAD, a obser morte neuronalved foi sutil, dependente da idade, e isolado para algumas regiões selecione 7,8.
A infusão direta de oligomeric Ap 1-42 no cérebro do rato do tipo selvagem é um excelente modelo in vivo que replica o aspecto morte neuronal de amyloidopathy 1,9,10. Ao contrário dos modelos de ratinho transgénicos vulgarmente utilizados o modelo de infusão oligomérico Ap 1-42 é ideal para elevar de forma aguda Ap 1-42 níveis de um modo espacial e temporal. A vantagem da utilização de ratinhos de tipo selvagem para este modelo de compensação ou elimina efeitos colaterais potenciais de mutações introduzidas em linhas de ratos transgénicos. Estudos anteriores têm demonstrado que a infusão de níveis tóxicos de Ap 1-42 no hipocampo provoca a morte neuronal na proximidade do local de injecção dentro de 1 semana 1. Além disso, consistente com a observação de que Ap 1-42 é tóxico para os neurónios colinérgicos do prosencéfalo basal 11população colinérgicos neurônio (BFCN) que se projecta para o hipocampo diminui 20-50% no prazo de 7-14 dias após a beta-amilóide infusão 1,10 em camundongos, de forma eficaz permitindo que para os exames de circuitos neuronais isolado no cérebro. Desde projecto BFCN ipsilateralmente ao giro dentado do hipocampo 12, para a maior parte de controlo / veículo e oligoméricos Ap 1-42 soluções podem ser injectados em ambos os lados do cérebro, permitindo que sejam feitas comparações entre os hemisférios direito e esquerdo 1.
Neste relatório, iremos fornecer uma metodologia cirúrgica ea injeção detalhado para adultos de tipo selvagem camundongos C57BL / 6J. Esta estirpe do mouse é escolhido por causa de sua ampla utilização na pesquisa. Tecnicamente, qualquer região do cérebro podem ser direcionados para perfusão, no entanto aqui, vamos utilizar o giro denteado do hipocampo como o alvo para ilustrar a técnica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para conseguir um sucesso Ap 1-42 injeção do experimentador ou cirurgião deve: 1) utilizar uma técnica asséptica; 2) identificar corretamente a região do cérebro de interesse com coordenadas precisas; 3) ser capaz de garantir adequadamente o mouse no quadro estereotáxico com o cérebro nivelado no eixo AP e ML; 4) tem a capacidade de operar o micromanipulador com precisão; 5) Garantir cuidados pós-operatórios adequada. Se essas etapas principais são seguidos do mouse deve sobreviver à cirurgia se…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame conceder NS081333 (a CMT), concessão Associação NIRG-10-171721 de Alzheimer e Instituto Nacional de Saúde Mental de concessão MH096702 (a UH), e do Instituto Nacional sobre Envelhecimento financiado pela pesquisa da doença de Alzheimer Centro da Universidade de Columbia concessão piloto AG008702 (para YYJ e JB).
Materials
| Ketamine HCl (100mg/ml) | Henry Schein Medical | 1049007 | 100 mg ketamine per 1 kg animal |
| Xylazine (20mg/ml) | Henry Schein Medical | not available | 10 mg xylazine per 1 kg animal |
| Buprenex (0.3mg/ml) | Henry Schein Medical | 1217793 | 0.1 mg buprenex per 1 kg animal |
| Aβ1-42 | David Teplow/UCLA | not available | 100 μM; This amyloid was used in the paper |
| Aβ1-42 | Bachem | H-1368 | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
| Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-80B | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
| Scrambled Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-46B | Can be used as control peptide for comparing Aβ1-42 |
| NU4 Antibody (Oligomeric Amyloid Antibody) | Gift from William Klein/Northwestern U. | not available | 1:2000 dilution |
| Anti-Amyloid Oligomeric Antibody (Polyclonal Rabbit) | EMD Millipore | AB9234 | May be used in place of Nu4; needs to be tested by the end user |
| 6E10 Antibody (Monoclonal Mouse) (Amyloid Antibody) | Biolegend | sig-39320 | 1:1000 dilution |
| ChAT Antibody (Polyclonal Goat) | Millipore | AB144P | 1:100 dilution |
| DeadEnd Fluorometric TUNEL system | Promega | G3250 | Follow manufacturer's directions for use |
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Use when coverslipping slides |
| Fluorogold | Fluorochrome, LLC | not available | 2% solution |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | For making 70% ethanol for sanitizing and disinfecting |
| Novex 10-20% Tricine gel | Life Technologies | EC6625BOX | For separating Aβ1-42 |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Life Technologies | LC1675 | For running 10-20% Tricine gels |
| Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Life Technologies | LC3675 | For transferring 10-20% Tricine gels |
| SuperSignal Western Blot Enhancer | Thermo Scientific | 46640 | For enhancing Aβ1-42 signal; follow manufacturer's protocol |
| Protran BA79 Nitrocellulose Blotting Membrane, 0.1 μm | GE Healthcare Life Sciences | 10402088 | For transferring 10-20% Tricine gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | Electrophoresis aparatus for running 10-20% Tricine gels |
| GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores |
| Refresh Optive Lubricant Eye Drops | Allergan | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores; Can be used in place of GenTeal |
| Betadine | Stoelting | 50998 | For sanitizing and disinfecting |
| Round/Tapered Spatula | VWR | 82027-490 | For opening animal mouth |
| Bulldog Serrefines Clamps (Jaw Dims. 9X1.6mm; Length 28mm) | Fine Science Tools | 18050-28 | Optional; For keeping scalp skin apart during injection |
| Straight Fine Scissors (Cutting edge 25mm; Length 11.5cm) | Fine Science Tools | 14060-11 | For cutting scalp |
| #3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| #11 Surgical Blade | Fine Science Tools | 10011-00 | For making scalp incision |
| Student Standard Pattern Forcep (Tip Dims. 2.5×1.5mm; Length 11.5cm) | Fine Science Tools | 91100-12 | For holding scalp closed during suturing |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | For shaving hair |
| T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific | TP-700 | For warming animal during surgery |
| Resusable Warmining Pad (5" x 10") | Kent Scientific | TPZ-0510FEA | For attaching it to the T/Pump warm water recirculator to warm the animal during surgery |
| Cordless Micro Drill | Stoelting | 58610 | Use 0.8mm steel burrs to drill holes in the skull |
| Lab Standard Stereotaxic Instrument with Mouse & Neonatal Rat Adaptor | Stoelting | 51615 | |
| Just for Mouse Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51730 | Can use this in place of Stoelting Cat. #51615 |
| Quintessential Stereotaxic Injector | Stoelting | 53311 | |
| Dry Glass Bead Sterilizer | Stoelting | 50287 | For sterilizing stainless steel instruments |
| Sterile Surgical Drape (18" x 26") | Stoelting | 50981 | |
| Hamilton Syringe 50 ml, Model 705 RN SYR, NDL | Hamilton Company | 7637-01 | For brain injection; use different syringes for different solutions |
| 29 Gauge Needle, Small Hub RN NDL | Hamilton Company | 7803-06 | For attaching to the Hamilton syringe for brain injection |
| 1 ml BD Tuberculin Syringes | VWR | BD309659 | For administering anesthesia and saline |
| 30 Gauge Needle (0.5") | VWR | BD305106 | For administering anesthesia and saline |
| Portable Electronic CS Series Scale (Ohaus) | VWR | 65500-202 | For weighing animals to determine anesthesia dose |
| Hot plate (Top Plate Dims. 7.25×7.25in) | VWR | 47751-148 | For warming animals post-surgery |
| Sofsilk Silk Suture C-1 Cutting 3/8, 12 mm | Covidien | S1173 | For closing wound |
| Vetbond Tissue Adhesive (3M) | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | Optional: for aiding in wound closure; Use with suture. |
| Cotton-Tipped Wooden-Shaft Sterile Applicators | Fisher scientific | 22-029-488 | For cleaning and drying surgical wound |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | For collecting brain sections |
| VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm | VWR | 48393241 | For mounting microscope slides |
| Thermo Scientific Nalgene Syringe Filter 0.2 μm | Fisher Scientific | 194-2520 | For sterilizing saline solution |
| Sterile dual tip skin markers by Viscot Medical | Medline | VIS1422SRL91 | For marking coordinates on the skull |
Riferimenti
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