Abstract
Syntetiske materialer er kjent for å initiere kliniske komplikasjoner som inflammasjon, stenose, og infeksjoner når implantert som vaskulære substitutter. Kollagen har vært i utstrakt bruk for en lang rekke biomedisinske anvendelser, og er ansett som en gyldig alternativ til syntetiske materialer på grunn av sin iboende biokompatibilitet (dvs. lav antigenisitet, inflammasjon og cytotoksiske responser). Imidlertid har de begrensede mekaniske egenskaper og relaterte lav hånd-evne kollagen gels hemmet deres bruk som stillasmateriell for vaskulær tissue engineering. Derfor er begrunnelsen bak dette arbeidet var først å konstruere cellularized kollagen gelen i en rørformet geometri og andre for å forbedre glattmuskelceller drevet reorganisering av kollagen matriks for å oppnå vev stive nok til å kunne håndteres.
Den strategi som er beskrevet her er basert på den direkte montering av kollagen og glatte muskelceller (konstruere) i et 3D cylindrical geometri ved bruk av en støpeteknikk. Denne prosessen krever en modningsperiode, under hvilken konstruksjonene dyrkes i en bioreaktor under statiske betingelser (uten påsatt ytre dynamiske mekaniske begrensninger) for en eller to uker. Den "statisk bioreaktor" gir en overvåket og kontrollert sterilt miljø (pH, temperatur, gassutveksling, næringstilførsel og fjerning av avfall) til konstruksjonene. I løpet av dyrkningsperioden ble tykkelsesmålinger utført for å evaluere celler drevet ombygging av kollagenmatriksen, og glukoseforbruk og laktatproduksjon rater ble målt til å overvåke cellene metabolsk aktivitet. Til slutt ble det mekaniske og viskoelastiske egenskaper vurderes for de resulterende rørformede konstruksjoner. For dette formål, spesifikke protokoller og en fokusert kunnskaper (manipulasjon, gripende, som arbeider i hydratisert miljø, og så videre) ble utviklet for å karakterisere de konstruerte vev.
Introduction
Vaskulær tissue engineering ser for seg ulike strategier rettet mot fabrikasjon av konstruerte fartøy, inkludert grafts basert på syntetiske stillaser, celle sheet-baserte vev-konstruert blodkar (TEBVs) og ekstracellulære matrix (ECM) komponenter basert TEBVs. Blant disse metodene, syntetiske polymerer som oppviser gode mekaniske egenskaper, men har en felles ulempe som de mangler en bioaktivitet. Cellen ark basert metode tillater produksjon av konstruerte vaskulære erstatninger med høye mekaniske egenskaper, men den tid som kreves for å produsere slike grafts er omtrent 28 uker 2. Naturlige biopolymerer av ECM, slik som kollagen, elastin, fibrin 3 eller en kombinasjon derav, være gullstandarden materialer av vev stillaser. Dette er først og fremst på grunn av at disse materialene har en generelt god biokompatibilitet og være i stand til å indusere funksjonelle cellulære responser 4-5. Blant disse biopolymers, type I kollagen er en av de mest tallrike og dominerende bærende protein ifølge ECM i mange vev, slik som hud, sener og blodårer. Omfattende arbeid har blitt utført på de mekaniske egenskaper av kollagen 6 - 8, men det har vært få studier på cellulær ombygging av kollagen geler i løpet av statisk modning. Cellular ombygging refererer til de strukturelle modifiseringer av kollagen matriks indusert av celler som kan påvirke stabiliteten av kollagen fibriller nettverk 9. Som en naturlig stillas, kan forholdsvis store mengder av type I kollagen isoleres, steriliseres og lagres fra forskjellige kilder slik som rotte-hale sener 10. Forstå cellulære interaksjoner med kollagen og tilknyttede generelle mekaniske atferd av cellularized kollagen stillaser (konstruerer) er et viktig skritt for bygging av vev. Kollagen-baserte TEBVs kan behandles ved direkte å blande celler med kollagengel under fremstillingen og videre støpes til bestemte former som rørformet og plane 11. Vaskulære celler inne i gels sprer og oppussing type I kollagen 12. Således, omgår denne metoden behovet for spesifikk makroporøsitet som representerer en av de viktige problemene i utviklingen av stillas for vev tekniske anvendelser. Imidlertid har de store ulempene med kollagen geler er deres lave mekaniske egenskaper sammenlignet med syntetiske materialer 13.
I denne studien ble en levedyktig vev med homogen fordeling av celler konstruert ved direkte blanding av kollagen med celler i en ett-trinns prosess. "Statiske bioreaktorer" ble brukt til en eller to uker med statisk modning av cellularized kollagen gels (uten påført ytre dynamiske mekaniske begrensninger). Under kultur, kollagenmatriksen ombygging inntraff, og dermed gi strukturell forsterkning til konstruksjonene. Videre har disse konstruksjoner ble ready å bli overført til en roterende vegg bioreaktor og en homogen endotel var oppnådd. I tillegg, i dette arbeidet en spesifikk mekanisk testprotokollen er også foreslått å gi en passende ny fremgangsmåte for å karakterisere de mekaniske egenskaper for rørformede bløtvev.
Oppsummert viser dette arbeidet en fremgangsmåte for in vitro hurtig fabrikasjon og modning av vaskulært vev som er sterke nok til å kunne håndteres, ikke bare for biologiske og mekaniske karakteristikker, men også for ytterligere mekanisk kondisjonering i en dynamisk bioreaktor, som er ansett som et viktig trinn i regenerering av vev.
Protocol
1. Fabrikasjon og sammenstilling av Static Bioreactor
- Fabrikasjon av reservoaret
- Forbered 50 ml sentrifugerør som et kulturmedium reservoar for bioreaktoren.
- Lag to porter ved å bore to 5 mm i diameters hull ved 20 mm fra bunnen og toppen av reservoaret, henholdsvis. Deretter setter to luer beslag i 5 mm lengde silikon rør. Trykk-passe disse luer beslag gjennom hullene, og forsegle alle forbindelser med medisinsk silikon lim.
- Sett inn en 0,22 mikrometer filter i den øvre port av reservoaret (figur 1A).
- Sett en luer skillevegg inn i den nedre port av reservoaret (figur 1A).
- Dor-cap Assembly
- Bor et 4,5 mm hull i sentrum av det ventilerte lokket av reservoirrøret uten å skade filtermembran som dekker luftehullene.
- Forbered oppsikt bar (diameter = 4,5 mm, lengde = 100 mm) Som en spindel for konstruksjonen.
- Forbered to silikon koniske stoppere (lengde = 10 mm, midterste hullet diameter = 4,5 mm).
- Montere doren og lokket (mandrel-cap kompleks) som beskrevet i figur 1B.
- Presspasning på spindelen inn i hullet. Sett i de to stoppere over doren, slik at lokket er montert mellom dem. Justere stillingen av spindelen, slik at dens lengde er 78 anvendelige mm.
- Påfør en primer og deretter medisinsk silikon lim på overflater som kommer i kontakt før han begynte i hetten og silikon koniske stoppere sammen. Fjerne overflødig lim på hetten.
- La det tørke ved romtemperatur i 1-3 dager.
- Fabrikasjon av gasbind-grep
- Forbered tre silikon rør (rør 1: indre diameter = 6,4 mm, lengde = 5 mm, tube 2: diameter = 6,4 mm, lengde = 10 mm, og rør 3: diameter = 3,1 mm, lengde = 12 mm).
- Monter gasbind-grep som beskriverd i figur 1C.
- Cut tube en langsgående, og åpne den over røret 2. Hold dem sammen med silikon lim.
- Skjær steril kirurgisk gasbind til 5 cm x 7 cm ark, og deretter rulle tett gasbind over rør 3 langs den lengste siden av gasbind. Sett røret 1-rør 2 kompleks over gasbind.
- Legg silikon lim for å holde sammen gasbind, røret 1-rør 2 kompleks og røret 3. Kutt gasbind på en lengde på 8 mm.
- Montering og Sterilisering
- Montere doren-cap komplekset og gasbind-grep, som beskrevet i figur 2.
- Coat stammen med medisinsk karakter fett (Figur 2A). Plasser gasbind-grep over stammen (figur 2B). Distansere grepene på fast verdi på 35 mm fra hverandre.
- Tilbered en rørformet form ved å fjerne den nederste del av en 10 ml sprøyte ved hjelp av en tabell sag (endelig lengde = 8 mm) (
- Sett formen over gasbind fatt utstyrt dor-cap forsamlingen (bolig-mold kompleks), snap sittende formen på silikonpropp (Figur 2C).
- Autoklaver i reservoaret og huset-formen kompleks.
Merk: Vær forsiktig med å holde på silikonpropp tett når du setter formen for å unngå sin løsrivelse.
- Montere doren-cap komplekset og gasbind-grep, som beskrevet i figur 2.
2. Engineering glattmuskelcellet Collagen Gel-baserte konstruksjoner og Static Modning
- Ingeniør konstruksjoner
- Utvide svin glatte muskelceller fra aorta (pSMCs) i 175 cm 2 kulturflasker som er fylt med 20 ml komplett kulturmedium bestående av Dulbeccos modifiserte Eagle-medium supplert med 10% (v / v) svine-serum (PS), 10% (v / v ) føtalt bovint serum (FBS), 1% (volum / volum) penicillin-streptomycin (pen-strep).
- På ≈90% samløpet, løsne pSMCs (passasje 2-4) ved å fjerne kulturmedium frakolbe av pSMCs, tilsetning av 5 ml trypsin-løsning (1x i fosfatbufret saltoppløsning, PBS), og inkubering i 10 min (T = 37 ° C, 5% CO2, 100% fuktighet).
- Resuspender pSMCs ved en konsentrasjon på 4 x 10 6 celler / ml i komplett dyrkingsmedium.
- Forbered kollagen løsning som tidligere beskrevet 10.
- Trekke ut og samle kollagen pakker fra rottehale sener i en PBS løsning.
- Overfør kollagenfibre deretter i aceton (5 min), 70% isopropanol (vol / vol) (5 min) og eddiksyre (0,02 N, 48 timer, 4 ° C) løsninger.
- Bland den viskøse løsning og fryse ved -20 ° C i 3 dager.
- Lyofilisere den frosne løsning for å få kollagen svamper.
- Oppløseliggjøre kollagensvamper i eddiksyreløsning (0,02 N) ved en konsentrasjon på 4 g / l og sentrifuger ved 29 581 g kraft i 45 minutter.
- Sterilisere kollagen løsning gjennom dialyse prosessen mot påfølgende s-vedtak eddiksyre (0,02 N, 1 time), kloroform 1% (v / v, 1 time) og eddiksyre (0,02 N, steril oppløsning endret hver 2 dager til en uke).
- Samle sterile collagen-oppløsning (4 g / l) i en steril cellekultur hette.
- Forbered cellularized kollagen gels som vist i Figur 3.
- Forbered 50 ml sterilt bufferoppløsning ved å blande 35 ml av DMEM (5x), 4 ml av HEPES (1 N), 3 ml av NaOH (1 N) i 8 ml sterilt avionisert vann.
- Forbered celler og kollagen gel blandingen i en beholder plassert på is ved å blande 50% (v / v) steril collagen-oppløsning (4 g / l eddiksyre 0,02 N) ved 25% (v / v) av bufferløsning og 25% (v / v) av suspensjonen av pSMCs i fullstendig kulturmedium.
- Måling av pH i blandingen, og at det er mellom 7,0 og 7,4.
- Hell forsiktig 9 ml celler og-kollagen blandingen i ovennevnte huset / mold kompleks (trinn 1.4.3, figur 3A-B
- La det gel ved romtemperatur i 1 time under cellekultur hette (figur 3B).
- Modning i Static Bioreactor
- Fjern formen (figur 3C) og overføre forsiktig konstruksjonen inn i reservoaret, som inneholder 35 ml av kulturmediet (figur 3D).
- Inkuber konstruksjonen (T = 37 ° C, 5% CO2, 100% fuktighet) i vertikal stilling på en eller to uker etter statisk modning.
- Installere et web-kamera (forseglet for å sikre isolasjon) på innsiden av inkubator foran konstruksjonen.
- Endre dyrkningsmediet etter 2 dager ved aspirering av gamle mediet fra luerporten septum og re-fylling av reservoaret med en tilsvarende mengde frisk kulturmedium.
- Måling av tykkelse og metabolsk aktivitet av SMC-kollagen Gel-baserte konstruksjoner Under Statisk Culture
- Plasser scanning laser interferometer i cellen Culture hette og snu den fra vertikal til horisontal posisjon ved hjelp av et vater.
- Overfør bioreaktoren i hetten cellekultur og fjerne konstruksjonen fra reservoaret.
- Overfør konstruksjonen (fortsatt montert på doren) inn i banen til laserstrålen, og plasser det strengt rettvinklet i forhold til stråleaksen (som vist i figur 4).
- Les verdien som vises på skjermen av scanning laser interferometer, som tilsvarer den ytre diameter på konstruksjonen.
- Beregne veggtykkelsen til konstruksjonen basert på sin utvendige og innvendige diameter (dvs. diameteren doren).
Merk: Gjenta trinnene 2.3.1 til 2.3.5 hver time for første 12 timer og deretter hver 24. time. - Bruker 1 ml av det gamle kulturmediet (samplet ved endring av dyrkningsmediet, trinn 2.2.4) for måling av laktat og glukosekonsentrasjoner med den blodgass-analysator.
- Bruker 1 ml avfriskt kulturmedium som en baseline nivå for glukose og laktat konsentrasjoner målinger 14.
Merk: Gjenta trinnene 2.3.6 og 2.3.7 hver 2 dager etter dyrkingsmedium endring.
- Konstruer Høsting for ytterligere mekanisk og biologisk Ccharacterizations
- Etter en eller to uker etter statisk modningsperiode, å overføre den statiske bioreaktoren i hetten cellekultur.
- Overfør forsiktig modne konstruksjonen fra sin dor (Opplysning Video 1) til en diameter på 100 mm petriskål inneholdende 40 ml friskt kulturmedium (figur 5 og figur 7a).
3. mekanisk karakterisering av konstruksjonene i langsgående og omkrets anvisninger
- Installer eksperimentelle oppsettet som består av mikromekanisk tester utstyrt med en 5 eller 10 N belastningscelle og et bad inneholdende PBS ved 37 ° C for å holde prøvene aT pseudo-fysiologiske forhold (figur 6).
- Balansere belastningen cellen og ekstensometer.
Merk: Balansering er en funksjon integrert i mikromekanisk tester som består i å tilbakestille den viste forlengelsesverdi og den viste lastverdi mens ingen prøve er montert på maskinen. Denne funksjonen gjør det mulig å definere referansen for begge målingene. - Montering de rørformede konstruksjonene på mekanisk apparat: lengderetning.
Merk: Utfør langsgående tretthet tester direkte på hele rørformede konstruksjoner. Bruk in-house-innegripeinnretninger for å forbinde gasbind grep av konstruksjonene til lastcellen, og til bunnen av PBS-bad.- Monter røret konstruere på gripeinnretninger (figur 7B), etter høsting prosedyre (punkt 2.4).
- Pakk gripeorganene og gasbind grepene sammen med teflon tape for å hindre at noen slipping av gasbind fatt under testen.Monter prøven på mikromekanisk tester (figur 7C).
- Montering av ringformede konstruksjoner mot mekanisk apparat: omkretsretningen.
Merk: Utfør perifere tretthetstester på ringformede prøver seksjonert fra de rørformede konstruksjoner. Bruk to rustfrie stålstenger som grep for å holde prøvene.- Monter røret bygge på et plastrør som en støtte merket med 5 mm hull (Figur 7B), etter høsting (§ 2.4).
- Kutt 10 mm ringer fra røret konstruere.
- Måle lengden av prøven med en verniercaliper for videre analyser.
- Monter ringformede prøven på rustfritt stål barer av mikromekanisk tester (figur 7C). Sørg for å plassere prøven i sentrum av barene.
Merk: plastrør i trinn 3.4.1 og et skjæresystem som vist i figur 7B
- Tretthet test på konstruksjonene i lengde- eller omkretsretning.
- Strekk konstruksjonen til sin opprinnelige måleren lengde.
- Opprettholde konstruere i denne stillingen i 10 min i pseudo-fysiologisk miljø.
- Anvende 10% syklisk belastning av den opprinnelige målelengde (30 sykluser) for å konstruere på 5% / sek tøyningshastighet.
- Gjenta trinn 3.5.3 i inkrementelle trinn på 10% syklisk belastning inntil svikt av prøven.
Merk: Bruken av pseudo-fysiologisk miljø krever at det tas hensyn til oppdrift og tregheten i gripesystemet som påvirker målingen av den påførte belastning. - Spill bakgrunnen som følger:
- Kjør lasterammen til den opprinnelige målelengde.
- Gjenta trinn 3.5.3 og 3.5.4 uten noen prøve montert, og å holde gripeorganene som er koblet til lastcellen (bare en syklus er krav som stillesrød).
4. Luminal endotelialisering av konstruksjoner
Merk: Etter følgende høste protokoll (avsnitt 2.4), konstruksjonene tåle håndtering for å være montert i den roterende vegg-bioreaktor for den videre endotelialisering.
- Roterende vegg Bioreactor Design
- Bor et 4,5 mm hull i sentrum av det ventilerte lokket av reservoirrøret uten å skade filtermembran som dekker luftehullene.
- Presstilpasset en dor (diameter = 4,5 mm, lengde = 40 mm) inn i hullet og feste doren som beskrevet i trinn 1.1.2.
- Forbered to C-formede silikon støtte for konstruksjonen ytre diameter = 14 mm; indre diameter = 8 mm).
- Plasser en roterende motor i den ene enden av den roterende vegg og en bioreaktor betydning for andre ende (figur 8B).
- Lumen endotelialisering
- Utvid menneskelig umbilical vene endotel-celler (HUVECs) i 25 cm kulturflasker 2 med 5 ml M199 kulturmedium supplert med 10% (v / v) PS, 10% (v / v) FBS, 1% (v / v) pen-strep i petriskål inne i en inkubator (T = 37 ° C, 5% CO2, 100% fuktighet) til 90% konfluens.
- Forbered 1,5 ml proteinbeleggløsning per konstruksjon som kreves for optimal celleadhesjon ved å fortynne konsentratet proteinblandingen til 10,5 ng / ml i serumfritt endotelial cellekulturmedium.
- Måle lengden av konstruksjonen ved hjelp av en verniercaliper.
- Beregn luminal volum V og luminal området A av konstruksjonen som: V = D i 2 L / 4, og A = D L i henholdsvis (hvor D er den indre diameter tilsvarende diameteren doren, og L er lengden av konstruksjonen).
- Plassere konstruksjonen på midten av reservoaret etter høsting fremgangsmåte (avsnitt 2.4).Bruk C-formet silikon støtte for å feste konstruksjonen i begge ender til reservoaret (figur 8A).
- Fyll tanken med 35 ml kulturmedium.
- Fyll 75% av den beregnede luminal volumet av konstruksjonen (V) med proteinbeleggløsningen fremstilt i trinn 4.2.2. Lukke begge endene av konstruksjonen for å unngå enhver lekkasje av proteinbeleggløsning (figur 8A).
- Monter den roterende vegg bioreaktor system inne i hetten cellekultur.
- Plasser bioreaktoren i en 37 ° C inkubator og starte rotasjon av bioreaktoren ved 4,02 x 10 -5 g kraft i 1 time for å tillate at luminal belegget som vist i figur 8B.
- Åpne øvre ende av konstruksjonen og aspireres proteinbeleggløsningen fra lumen.
- Løsne HUVECs (passasje 2-3) ved å fjerne dyrkningsmediet fra kolben og tilsetning av HUVECs 3 ml av trypsin-oppløsning (1 x i PBS). Jegncubate i 5 min (T = 37 ° C, 5% CO2, 100% fuktighet).
- Resuspender HUVECs ved en konsentrasjon på 4 x 10 6 celler / ml i supplert M199 kulturmediet.
- Inne i cellekultur hette, frø HUVECs inn i hulrommet i konstruksjonen med en tetthet på 1000 celler / cm2 15. Lukk øvre ekstremiteter av konstruksjonen for å unngå enhver lekkasje av HUVECs løsningen.
- Inkuber konstruksjonene (T = 37 ° C, 5% CO2, 100% fuktighet) hostet til den roterende vegg bioreaktor (figur 8B) og dyrking i 2 dager ved en konstant rotasjon av 4,02 x 10 -5 g kraft.
- Høste konstruksjonen etter 2 dager med kultur i sterile forhold og gjør den klar for videre biologisk karakterisering som beskrevet i kapittel 2.4.
Representative Results
Dette arbeid beskriver fremstilling av konstruerte rørformede kollagenbaserte konstruksjoner inneholdende vaskulære celler. Allerede etter en time for tidlig gelering, ble celler-og-kollagen blandingen direkte montert i et 3D rørformet geometri, med den ytre diameter lik diameteren av den tilsvarende formen (ca. 14 mm). Alle sammen statisk modning, målinger viste den raske reduksjon av den utvendige diameter av de rørformede cellularized strukturer, slik som vist i tabell 1. Diameteren på cellularized kollagen geler krympet på omtrent 60% av sin opprinnelige verdi etter en dag med statisk kultur, og på nesten 85% i løpet av 7 dager (Opplysning Video 2). SMC innen konstruksjonene er ansvarlig for den observerte krymper og relaterte mekaniske forsterkning, da dette fenomen ikke forekommer i ikke-cellularized kollagen stillaser. Legg merke til at ingen gradient av enhver type (termisk, biokjemisk, mekaniske, eller andre) ble brukt. Cellene-stasjonenN komprimering resulterte i et materiale med større tetthet kollagen som kan håndteres og dempet til mekaniske anmodninger (Supplemental filmer 3 og 4).
Å relatere celler-drevet ombygging til de overordnede mekaniske og viskoelastiske egenskaper, ble tretthets tester utført på konstruksjonene (Supplemental Videoer 5 og 6). Disse forsøk besto i å sykle konstruksjonene (30 ganger) ved forskjellige konstante stammer (10%, 20% og 30% av den opprinnelige målelengde) og til å ta opp belastning som responsen av konstruksjonene til den mekaniske oppfordring over tid. De representative resultater for en konstruksjon som er vist i figur 9. Konstruksjonen motsto høyere spenninger i lengderetningen (75 kPa) enn i omkretsretningen (16 kPa) når den utsettes for den samme stamme området (30% belastning). I mellomtiden, ved hver syklus, nådde spenning toppverdi for TArgeted maksimal belastning redusert over tid. Denne oppførsel er typisk for de høye viskoelastiske egenskaper som oppvises av disse kollagen-baserte konstruksjoner.
Den biologiske aktivitet av cellularized konstruksjonene ble bedømt i løpet av statisk modning. Derfor ble metabolsk aktivitet av SMC evaluert ved å måle glukoseforbruk og laktatproduksjon i løpet av statisk kultur. Dyrkingsmedium ble samplet hver 2 dager og glukose og laktatkonsentrasjonen ble målt ved hjelp av en blod gass analysator. Den stadige økningen i glukoseforbruk og laktatproduksjon kombinert til den viktige krymping av konstruksjonene, bekrefter den SMC-aktivitet hele tiden statisk kultur (figur 10).
Den økte mekanisk stabilitet på grunn av den celledrevne ombygging tillot manipulering av konstruksjonene, og den etterfølgende prosessen endotelialisering. Masson er Trichrome farging utført på endothelialized konstruererviste en svært homogen endotelet. SMC oppviste en spindelformet morfologi og lignende dukket homogent dispergert gjennom veggen, mens HUVECs virket godt spredt i den luminale side (figur 11).
Fig. 1: Komponenter av den statiske bioreaktoren Den statiske bioreaktor besto av en modifisert 50 ml sentrifugerør (A) og en dor utstyrt hetten (B). Røret tjente som medium reservoaret, og er utstyrt med en port for et 0,22 mikrometer filter, for gassutveksling, og et septum, for mediet prøvetaking og endring. En dor er tilstede i det ventilerte hetten tillates fabrikasjonen av konstruksjonene i rørform. Gasbind-hylster (C) ble konstruert og fabrikert for å understøtte geldannelse av konstruksjonene over doren. Dessuten, dissegrep tillot konstruksjonene som skal behandles etter at den statiske modning og for å festes til den mekaniske anordning. Den ytre diameter av doren var 4,7 mm.
Figur 2: Montering av den statiske bioreaktor Montering faser av bioreaktoren før steriliseringen.. Gasbind-hylster ble montert på spindelen (A) i en fast avstand. En form ble innsatt (B) og tett festet til det silikonpropp (C). Den ytre diameter av doren var 4,7 mm.
Fig. 3: Fremstilling av konstruksjonene i sterile betingelser celler og kollagen Blandingen ble helt inn i huset-formen kompleks (A), og la gel i 1 time ved værelsestemperatur (B). Deretter ble formen fjernet (C), ble den statiske bioreaktoren montert (D) og overført i et reservoar for den statiske modningen av konstruksjonen i inkubator (T = 37 ° C, 5% CO2, 100% fuktighet). Den ytre diameter av doren var 4,7 mm.
Fig. 4: Måling av tykkelse / utvendige diameter av konstruerer en laser scanning interferometer ble brukt til å utføre målinger av de ytre diametre av konstruksjonene. Konstruksjonen ble plassert i banen til laserstrålen, og som genereres en skygge. Bredden av skygge, som tilsvarer den ytre diameter av konstruksjonen, ble deretter målt og vist på skjermen.
Fig. 5: Morfologisk utseende av høstet konstruksjonen (A) Like etter geleringen og (B) etter at cellene drevet remodeling under statisk modning i 2 uker.
Figur 6: eksperimentelle oppsettet for mekaniske karakteristikkene Den besto av mikromekanisk tester utstyrt med en 5 eller 10 N belastningscelle og et bad inneholdende PBS ved 37 ° C for å holde prøvene i pseudo-fysiologiske betingelser..
Figur 7: Eksempel på forberedelse f eller mekaniske karakteristikkene. Prøve høsting (A) og preparat (B) for tretthets tester utført i den langsgående og den perifere retning (C). Den ytre diameter av doren var 4,7 mm.
Figur 8: Roterende vegg bioreaktor (A) De rørformede konstruksjonene ble samlet i sentrum av reservoaret ved hjelp av C-formede silikon støtte.. Begge endene av konstruksjonen ble lukket for å unngå enhver lekkasje av HUVECs løsningen. (B) Konstruksjonene ble dyrket i inkubator (T = 37 ° C, 5% CO2, 100% fuktighet) i rotasjon ved 4,02 x 10 -5 g kraft i 2 dager.
2 / 52812fig9highres.jpg "width =" 700 "/>
Figur 9:.. Mekaniske characterizations Resultater av trøtthet tester utført på konstruksjoner i lengde (A) og omkrets (B) retninger etter cellestyrt ombygging Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 10: Metabolsk aktivitet av SMC i kollagen gelene Måling av glukoseforbrukshastigheten og laktatproduksjonshastighet ble utført med blodgass-analysator etter 2 dager, etter at dyrkingsmediet endring. Friskt kulturmedium ble anvendt som et utgangsverdien for glukose og laktat konsentrasjoner målinger.
Figur 11: Lumen endotelialisering Histologiske bilder av de radiale tverrsnitt av rørformede konstruksjoner.. Masson s Trichome farging av rørformede konstruksjoner dyrket statisk i en uke (A) og 2 uker (B). H & E farging av en rørformet konstruksjon (C).
| Tid | Tykkelse (mm) | Komprimering (%) |
| 0 hr | 4,83 ± 0,02 | 0 ± 0 |
| 2 timer | 4,26 ± 0,02 | 12 ± 0 |
| 4 timer | 4,21 ± 0,03 | 13 ± 1 |
| 6 hr | 4.06 ± 0.10 | 16 ± 2 |
| 12 timerr | 3.16 ± 0.07 | 35 ± 1 |
| 1 dag | 2,08 ± 0,11 | 57 ± 2 |
| 1 uke | 0,68 ± 0,07 | 86 ± 1 |
| 2 uker | 0,36 ± 0,00 | 93 ± 0 |
Tabell 1: Rapid komprimering av konstruksjonen diameter under den statiske modningen veggtykkelse på konstruksjonene og komprimeringen som funksjon av tid for statisk kultur.. Kompaktering ble målt ved å bestemme den utvendige diameter av de rørformede konstruksjoner med en scanning laser interferometer (Series 183B, LaserMike 136). Etter 24 timer konstruksjonene komprimert til 57% ± 2% av de støpte dimensjoner. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD (n = 3). Tilstedeværelsen og aktiviteten av levende glatte muskelceller ble det bare ansvarlig for slike store endringer.
Supplemental Video 1:. Høsting av ikke-oppusset rørformet kollagen gels Vennligst klikk her for å se denne videoen.
Opplysning Video 2:. Cells drevet komprimering av rørformede kollagen gels Vennligst klikk her for å se denne videoen.
Opplysning Video 3:. Manipulering av ikke-oppusset rørformet kollagen gels Vennligst klikk her for å se denne videoen.
Opplysning Video 4:. Manipulering av cellene oppusset rørformet kollagen gels Klikk her for å se ther video.
Opplysning Video 5:. Langsgående tretthet test (30%) på celler oppusset rørformet kollagen gels Vennligst klikk her for å se denne videoen.
Opplysning Video 6:. Omløp trøtthet test (30%) på celler oppusset rørformet kollagen gels Vennligst klikk her for å se denne videoen.
Discussion
Blant fellesskap av vaskulært vev ingeniører, er enorme anstrengelser blitt gjort for å reprodusere tunica media laget ansvarlig for den mekaniske stabilitet av blodkar 16. Siden den banebrytende arbeid for Weinberg og Bell 17, har kollagen blitt mye brukt som et stillas for vaskulær tissue engineering grunn av sin biokompatibilitet, ikke-immunogene egenskaper og tilgjengelighet. Men bruken av kollagen er en stor utfordring for forskere, da dette materiale ikke er lett å håndtere, på grunn av den iboende mangel på mekanisk stivhet. Manipulasjoner under stillaset preparatet kan skade stillasene, at det går dem for videre bruk.
Den teknikk som er beskrevet i dette arbeidet kan: i) å konstruere cellularized kollagen gel inn i en rørformet geometri, ii) å konstruere biologisk vev sterk nok til å kunne håndteres etter kort statisk modningsperiode (en eller to uker), iii) til såsess mekaniske og viskoelastiske egenskaper til slike rør-formet biologiske vev i to retninger. Celler i gelen spille en nøkkelrolle i kollagenmatriksen ombygging. Under modningsperioden, kontraktile SMC førte til komprimering av gelene som gir en konstruksjon med høyere mekanisk stabilitet som kan vurderes i den langsgående og periferiske retninger. Etterpå HUVECs seedet i luminal siden av konstruksjonene generert en homogen og levedyktig endotelet, og dermed demonstrere egnethet kollagen gels for vaskulære vev tekniske applikasjoner.
Bioreaktor presentert i dette arbeidet ble spesielt utviklet for å gi et optimalt miljø for cellevekst under statisk modning. I tillegg ble de anordninger som er utviklet for karakterisering av de mekaniske og viskoelastiske egenskaper av konstrukter utformet med sikte på å redusere eventuelle skader som ligger til manipulering avslike delikate materialer. Derfor ble den statiske bioreaktor utstyrt med et 0,22 mikrometer filter og en filtermembran på kapselen (trinn 1.1.2, figur 1A og B) som mulig for gassutveksling mellom kulturmediet på innsiden av reservoaret og inkubatoren, samtidig som et sterilt kulturmiljøet. Luer septum i bunnen ble brukt som en port for kulturmedium prøvetaking og endring i løpet av statisk kultur. Noen viktige skritt må tas hensyn til ved konstruksjon fabrikasjon og karakterisering. Alle manipulasjoner (utført i trinn 2.1.1 og i de etterfølgende trinn) som kan endre sterilitet av systemet ble utført i en steril biologisk hette. Celler og kollagen gel blanding forberedelse ble håndtert på is for å forsinke geleringsprosessen (trinn 2.1.4 til 2.1.7). I trinn 2.1.7, eventuelle luftbobler fanget i blandingen før gelering er potensielle stresset konsentrasjon områder som kan kompromittere slønnsomhet av konstruksjonene. Derfor krever fjerning av slike luftbobler lett risting montering eller ved hjelp av medisinsk vakuum i 3 minutter for degasing i sterile betingelser. Til slutt ble grepene spesielt utformet for å holde aksen til spindelen sentralt i den rørformede formen under gelering og for å tillate manipulering av delikat konstruksjonene ved høsting (fjerning av doren, seksjon 2.4), for endotelialisering, og for å lette montering på det mekaniske systemet (langsgående tester).
Den nåværende protokollen foreslår en original lett-å-prosessen alternativ tilnærming til forsterkning av kollagen gels konstruksjoner basert på naturlig iboende kontraktile potensialet i SMC. Vanlige teknikker for kollagen-matriser armering innebære bruk av fysiske og kjemiske tverrbindingsmidler som kan ha skadelige virkninger på celler-matriksinteraksjoner 18 - 20. Fabrikasjon teknikk presenteres idette arbeidet lar regissere denne celler-drevet ombygging prosessen for å gi en vev-konstruert konstruksjonen med målrettede mekaniske egenskaper uten noen fysisk eller kjemisk behandling.
Karakterisering av mekaniske og viskoelastiske egenskaper av hydrerte kollagen gels er en stor utfordring. I dette perspektivet beskriver den nåværende protokollen en original enkel og effektiv metode for å vurdere de mekaniske egenskapene rørformede bløtvev. Denne karakterisering kan utføres ikke bare i omkretsretningen, men også i lengderetningen, direkte på hele rørformede strukturen. Under mekanisk karakterisering, temperatur, vandig miljø, pH og ionestyrke er noen av miljøfaktorer som er kjent for å virke kraftig mekanisk oppførsel av biologiske vev 21. Derfor antyder en original oppsett og protokoll for mekanisk karakterisering av biologiske vev i en sterkt foreliggende arbeidreproduserbar pseudo-fysiologisk miljø (saltoppløsning ved 37 ° C og pH 7,4). Så langt vi kjenner til, har denne type karakterisering aldri blitt rapportert andre steder.
Konklusjonen er at den teknikk som foreslås i dette arbeidet demonstrerer den høye potensialet for direkte blanding av celler med kollagen til vaskulært vev tekniske anvendelser. Denne metoden sammen med den mekaniske karakterisering og endotelialisering prosess utgjør høye flerverdige protokoller. Derfor gjennom små modifikasjoner av set-ups og protokoller samtidig holde den samme begrunnelsen, viktigste kravene for ingeniør vaskulære vevsekvivalenter kan adresseres slik som rask og ukomplisert behandling, inkludert endotelialisering, og muligheten til å bli overført til et bredt spekter av myk vev med forskjellige lengder og diametere. Videre er forskjellig adherente celletyper, ECM-proteiner og støpte geometrier kan bli undersøkt for et antall målrettede applications, for eksempel ingeniør sener, hud grafts, hjerte patcher, nerver, blant andre. Selv om de mekaniske egenskapene til konstruksjonene er oppmuntrende, er de fortsatt lavere enn de innfødte vev. I denne sammenheng har vi overbevist om at en meget kort statisk modningstid er et viktig skritt mot den dynamiske stimulering i en bioreaktor, og dermed fører til en høyere strukturell integritet og mekanisk stabilitet. Men muligheten til raskt å produsere vev-konstruert cellularized kollagen-baserte konstruksjoner egnet for mekanisk og histologiske analyser gjør det statiske bioreaktor beskrevet her et nyttig og lovende verktøy for å gi innsikt i samspillet mellom celler og ECM under vekst og ombygging, eller til å brukes som en modell for terapi og medikament-leveringssystemer.
Disclosures
Ingen midler ble mottatt fra organisasjoner eller etater med potensiell interessekonflikt.
Acknowledgments
Denne forskningen ble finansiert av Natural Science and Engineering Research Council of Canada, den kanadiske Institute for Health Research og CHU de Québec Research Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CellTreat 50 ml Bio-Reaction tubes | CELLTREAT Scientific Products | 229-475 | Centrifuge tube |
| Male luer with lock ring x 1/8" hose barb. PP. 25/pk | Cole Parmer | RK-45503-04 | Luer fittings for "gas-exchange port" |
| Female luer x 1/8" hose barb adapter. PP. 25/pk | Cole Parmer | RK-45500-04 | Luer fittings for the "medium sampling port" |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 17. 25 ft. | Cole Parmer | RK-96410-17 | Tube 1 and 2 for the gauze grippers |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 16. 25 ft. | Cole Parmer | RK-96410-16 | Tube 3 for the gauze grippers |
| Silastic Medical adhesive silicone, type A | Dow Corning | - | Silicon glue for the fabrication of the static bioreactor |
| Polyvent 4 Vessel venting filters | Whatman | 6713-0425 | Filter for "gas exchange port" |
| Rod. PP. stirring. 8’’ | Scienceware | 377660008 | Mandrel |
| Stopper silicone rubber 00 PK12 | VWR | 59590-084 | Stopper for the insertion of the mandrel to the vented cap of the centrifuge tube |
| Krytox PFPE/PTFE Greases | Dupont | GPL 202 | Medical grade grease for covering the mandrel |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 | Cell culture |
| Xiameter RTV-4130-J base and curing agent | Dow Corning | - | C-shaped silicone support for endothelialization |
| Dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco (Life Technology) | 11995-065 | Cell culture |
| Pure acetone (99%) | Laboratoire Mat Inc. | AP0102 | Chemical for collagen extraction |
| Isopropyl alcohol (HPLC grade, 99.9%) | Fisher Scientific | AC610080040 | Chemical for collagen extraction |
| 0.02 N acetic acid (glacial acetic acid, HPLC grade, 99%) | Fisher Scientific | FL070494 | Chemical for collagen extraction |
| Chloroform solution (99%) | Laboratoire Mat Inc. | CR 0179 | Chemical for collagen extraction |
| Hepes | Sigma-Aldrich | 163716 | Chemical for construct preparation |
| NaOH | Laboratoire Mat Inc. | SR-0169 | Chemical for construct preparation |
| LaserMike 136 | LaserMike | Series 183B | Scanning laser interferometer |
| ElectroPulse MicroTester | Instron Corporation | - | Micromechanical Tester |
| HyClone Media M199/EBSS, 500 ml | GE Healthcare Life Sciences | SH30253.01 | Component of cell culture medium |
| Fetal bovine serum HI - 500 ml | Gibco | SH 30396.03 | Component of cell culture medium |
| Porcine serum (PS) | Sigma-Aldrich | P9783 | Component of cell culture medium |
| Penicillin-Streptomicin | Gibco | 15140-122 | Component of cell culture medium |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP661-50 | Saline solution |
| Tissue culture flask T17CN Vent Cap Red | Sarstedt Inc. | 83.1812.002 | Cell culture |
| ColorpHast- pH-indicator strips (pH = 6.5-10.0) | EMD | 9583 | pH measurements |
| Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 ml vial | BD Biosciences - Discovery Labware | 356230 | Concentrate protein mixture for endothelialization process |
| LifeCam VX-3000 | Microsoft | - | Thickness measurement |
| Biochemical analyzer, DxC600 | Beckman Coulter Unicell Synchron | - | Glucose and lactate concentrations measurements |
| Collagen fibers | Rat tails | - | Collagen was extracted in the laboratory |
| Porcine smooth muscle cells (pSMCs) | Porcine aortas | - | pSMCs were isolated in the laboratory |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Human umbilical veins | - | HUVECs were isolated in the laboratory |
References
- Kim, B. S., Nikolovski, J., Bonadio, J., Smiley, E., Mooney, D. J. Engineered smooth muscle tissues: regulating cell phenotype with the scaffold. Experimental cell research. 251, 318-328 (1999).
- Heureux, N., McAllister, T. N., de la Fuente, H. L. Tissue-engineered blood vessel for adult arterial revascularization. The New England journal of medicine. 357 (14), 1451-1453 (2007).
- Syedain, Z. H., Meier, L. A., Bjork, J. W., Lee, A., Tranquillo, R. T. Implantable arterial grafts from human fibroblasts and fibrin using a multi-graft pulsed flow-stretch bioreactor with noninvasive strength monitoring. Biomaterials. 32 (3), 714-722 (2011).
- Lee, C., Singla, A., Lee, Y.
- Couet, F., Rajan, N., Mantovani, D. Macromolecular biomaterials for scaffold-based vascular tissue engineering. Macromolecular bioscience. 7 (5), 701-718 (2007).
- Christiansen, D. L., Huang, E. K., Silver, F. H. Assembly of type I collagen: fusion of fibril subunits and the influence of fibril diameter on mechanical properties. Matrix Biology. 19 (5), 409-420 (2000).
- Eppell, S. J., Smith, B. N., Kahn, H., Ballarini, R. Nano measurements with micro-devices: mechanical properties of hydrated collagen fibrils. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 3 (6), 117-121 (2006).
- Lai, V. K., Lake, S. P., Frey, C. R., Tranquillo, R. T., Barocas, V. H. Mechanical behavior of collagen-fibrin co-gels reflects transition from series to parallel interactions with increasing collagen content. Journal of biomechanical engineering. 134 (1), 011004 (2012).
- Seliktar, D., Nerem, R. M., Galis, Z. S. The Role of Matrix Metalloproteinase-2 in the Remodeling of Cell-Seeded Vascular Constructs Subjected to Cyclic Strain. Annals of Biomedical Engineering. 29 (11), 923-934 (2001).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nature protocols. 1 (6), 2753-2758 (2006).
- Kumar, V. A., Caves, J. M., et al. Collagen-Based Substrates with Tunable Strength for Soft Tissue Engineering. Biomaterials science. 1 (11), 1193-1202 (2013).
- Li, S., Van Den Diepstraten, C., D’Souza, S. J., Chan, B. M. C., Pickering, J. G. Vascular smooth muscle cells orchestrate the assembly of type I collagen via alpha2beta1 integrin, RhoA, and fibronectin polymerization. The American journal of pathology. 163 (3), 1045-1056 (2003).
- Badylak, S. F., Freytes, D. O., Gilbert, T. W. Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function. Acta biomaterialia. 5 (1), 1-13 (2009).
- Engbers-Buijtenhuijs, P., Buttafoco, L., et al. Biological characterisation of vascular grafts cultured in a bioreactor. Biomaterials. 27 (11), 2390-2397 (2006).
- Cheung, A. L. Isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Current protocols in microbiology. 4, 4B (2007).
- Seifu, D. G., Purnama, A., Mequanint, K., Mantovani, D.
- Weinberg, C., Bell, E. A blood vessel model constructed from collagen and cultured vascular cells. Science. 231 (4736), 397-400 (1986).
- Meghezi, S., Chevallier, P., Mantovani, D. Why Mechanical Properties of Collagen Scaffolds Should Be Tested in a Pseudo-Physiological Environment. Advanced Materials Research. 409, 158-163 (2011).
- Tirella, A., Liberto, T., Ahluwalia, A. Riboflavin and collagen: New crosslinking methods to tailor the stiffness of hydrogels. Materials Letters. 74, 58-61 (2012).
- Madhavan, K., Belchenko, D., Tan, W. Roles of genipin crosslinking and biomolecule conditioning in collagen-based biopolymer: Potential for vascular media regeneration. Journal of biomedical materials research. Part A. , 16-26 (2011).
- Meghezi, S., Couet, F., Chevallier, P., Mantovani, D. Effects of a pseudophysiological environment on the elastic and viscoelastic properties of collagen gels. International journal of biomaterials. 2012, 319290 (2012).
