細胞透過性のCysを用いて哺乳動物細胞への直接タンパク質送達<sub> 2</sub> -His<sub> 2</sub>ジンクフィンガードメイン
Summary
ジンクフィンガードメインは、本質的に細胞透過性及び広範囲の哺乳類細胞型へのタンパク質の送達を媒介することができる。ここでは、細胞内タンパク質の送達のためのジンクフィンガーの技術を実施するための詳細なステップバイステップのプロトコルが提供される。
Abstract
Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.
Introduction
高効率と汎用性タンパク質の送達戦略は、多くの基礎研究および治療用途のために重要である。細胞への精製されたタンパク質の直接送達は、これを達成するための最も安全で簡単な方法のいずれかを表す。核酸からの遺伝子発現に依存する戦略とは異なり1,2、3-5タンパク質の送達は、挿入突然変異の危険をもたらすことはないとは無関係である細胞の転写/翻訳機構と即効することができます。しかし、タンパク質上に細胞透過活性の賦与するための簡単で一般化方法の欠如は、日常的に細胞への直接のエントリを混乱させる。細胞内タンパク質の送達を容易にするための現在の方法は、天然6-8または設計された細胞透過性ペプチド、9-12過給導入ドメイン、13,14ナノ粒子15およびリポソーム16ウイルス様粒子17,18発生の使用に基づいている</SUP>とポリマーマイクロスフェア材料。19残念ながら、これらのアプローチの多くは、低細胞取り込み率、20,21安定性が悪く、22不注意細胞型特異性、23低いエンドソーム脱出特性24と毒性によって妨げられている。さらに、25、多くのタンパク質形質導入技術は、配信するタンパク質の生物活性を減らす。14
キメラ制限がプログラム可能なのCys 2 -His 2ジンクフィンガーDNA結合タンパク質とFokI制限エンドヌクレアーゼ26-28の切断ドメインからなるエンドヌクレアーゼ- -本質的に無細胞である私たちの研究室では、以前ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）のタンパク質があることを実証した透過性。29この驚くべき細胞透過活性はカスタム設計ジンクフィンガードメイン、ターゲットゲノムENのための強力なツールとして浮上しているDNA結合プラットフォーム固有の性質であることが示されたgineering、30-32およびタンパク質表面の6つの正に荷電した残基のコンステレーションの結果であると考えられる。実際、c-Junの及びN-DEKを含むいくつかのDNA結合タンパク質は、細胞膜を通過する先天的能力を有することが示されている。 図33は、さらに最近では、我々の研究室では、これらの結果に展開され、亜鉛の細胞透過活性のことを実証指（ZIF）ドメインは、細胞内のタンパク質送達のために活用することができた。従来の多くの細胞透過性ペプチド送達システムを超えた効率性を取り込むために導いた特定のタンパク質の貨物に一次元または二本指をZIFドメインのどちらかの遺伝子融合。34最も顕著、ZIF媒介送達が融合した、酵素貨物の活性を危うくし、促進しませんでした細胞質ゾルデリバリーの高レベル。まとめると、これらの知見は、タンパク質の効率的かつ容易な送達を促進するためのZIFドメインの可能性を実証し、潜在的により多様な種類のマクロ細胞内への分子、。
ここでは、哺乳動物細胞におけるタンパク質の送達のためのZIF技術を実装する方法の詳細なステップバイステップのプロトコルが提供される。我々は以前に一次元、二次元、三、四速、五起因αヘリックスDNA結合残基のそれぞれの置換を、DNAに結合する能力を欠いている6フィンガーZIFドメインのスイートを構築したが、セル34（ 図1）にタンパク質を送達することができる。二本指ZIFドメインを使用してHeLa細胞にエメラルドGFP（EmGFP）の産生および形質導入が記載されている。このプロトコルは、 大腸菌での可溶性発現が可能なほぼすべてのタンパク質、ほぼ任意の哺乳動物細胞型に拡張可能である。期待される結果を提供し、このシステムのパフォーマンスを最大化するための戦略もまた、議論されている。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、細胞透過性のジンクフィンガー（ZIF）ドメインを用いてタンパク質送達のためのステップバイステップのプロトコルが提供される。 ZIFドメインは、融合した、酵素貨物34の活性を低下させない。非修飾タンパク質で観察されるものとほぼ同じ収率でのタンパク質の産生および精製を可能にする。そして伝統的な細胞透過性ペプチドまたはタンパク質導入ドメインシステム?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、とShanghaiTech大学、上海、中国（DP1CA174426カルロスF.バルバスへ）（JL）の国立衛生研究所によってサポートされていました。分子グラフィックスはPyMOLをを使用して生成された。
Materials
| XmaI | New England Biolabs | R0180L | |
| SacI | New England Biolabs | R0156L | |
| Expand High Fidelity PCR system | Roche | 11759078001 | |
| dNTPs | New England Biolabs | N0446S | |
| 4-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wells | Life Technologies | EC6028BOX | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | 161-0737 | |
| T4 DNA Ligase | Life Technologies | 15224-017 | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | New England Biolabs | C2527I | |
| IPTG | Thermo Scientific | R0391 | |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086-5G | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-25 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-25G | |
| DTT | Fisher Scientific | PR-V3151 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Ni-NTA Agarose Resin | QIAGEN | 30210 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513-25G | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMO Millipore | UFC900324 | |
| DMEM | Life Technologies | 11966-025 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-028 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| 24-Well Flat Bottom Plate | Sigma-Aldrich | CLS3527-100EA | |
| Poly-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| DPBS, No Calcium, No Magnesium | Life Technologies | 21600010 | |
| Heparan Sulfate | Sigma-Aldrich | H4777 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25300054 | |
| Hela cells | ATCC | CCL-2 | |
| Nano Drop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 |
Riferimenti
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