Dominios de dedos de zinc son células permeable intrínseca y capaz de mediar la entrega de proteínas en una amplia gama de tipos de células de mamíferos. Aquí, se presenta un protocolo detallado paso a paso para la implementación de la tecnología zinc-finger para la entrega de proteínas intracelulares.
Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.
Altamente estrategias de suministro de proteínas eficientes y versátiles son críticas para muchos la investigación básica y las aplicaciones terapéuticas. La entrega directa de proteínas purificadas en las células representa uno de los métodos más seguros y más fáciles para lograr esto. 1,2 diferencia de las estrategias que se basan en la expresión de genes a partir de ácidos nucleicos, 3-5 de administración de proteínas no plantea ningún riesgo de mutagénesis de inserción, es independiente de la maquinaria celular de la transcripción / traducción y permite un efecto inmediato. Sin embargo, la falta de métodos simples y generalizables para dotar a la actividad de penetración celular en proteínas confunde habitualmente su ingreso directo en las células. Los métodos actuales para facilitar la entrega intracelular de proteínas se basan en el uso de origen natural o diseñados 6-8 péptidos de penetración celular, 9-12 dominios de transducción de sobrealimentados, 13,14 nanopartículas y liposomas 15, 16 partículas similares a virus 17,18 </sup> y materiales de microesferas poliméricas. 19 Desafortunadamente, muchos de estos enfoques se ven obstaculizados por las bajas tasas de absorción celular, 20,21 pobre estabilidad, 22 inadvertida especificidad de tipo celular, 23 propiedades de escape bajo endosomales 24 y toxicidad. 25 Además, muchas proteínas tecnologías de transducción de reducir la bioactividad de las proteínas entregados. 14
Nuestro laboratorio previamente demostró que nucleasa dedo de zinc (ZFN) proteínas – restricción endonucleasas quimérico que consiste en una proteína programable Cys2 -Su 2 dedos de zinc de unión a ADN y el dominio de la escisión de la endonucleasa de restricción FokI 26-28 – son inherentemente por células permeable. 29 Esta actividad de penetración celular sorprendente ha demostrado ser una propiedad intrínseca del dominio dedo de zinc de diseño personalizado, una plataforma de unión a ADN que ha surgido como una poderosa herramienta para apuntado genoma eningeniería, 30-32 y considera que es el resultado de la constelación de seis residuos de carga positiva en la superficie de la proteína. De hecho, varias proteínas de unión al ADN, incluyendo c-Jun N-DEK y se han demostrado poseer una capacidad innata para atravesar las membranas celulares. 33 Más recientemente, nuestro laboratorio ampliado en estos resultados y demostró que la actividad de las células de penetración de zinc dedo (ZiF) dominios podrían ser aprovechados para la entrega de proteínas intracelulares. Fusión genética de cualquiera de los dominios ZIF de uno o dos dedos a la carga de proteína específica llevado a la absorción eficiencias que superan muchos sistemas de suministro de péptidos de penetración celular convencionales. 34 En particular, la entrega mediada por ZiF no comprometió la actividad enzimática de la carga fundida y facilitó altos niveles de entrega citosólica. En conjunto, estos resultados demuestran el potencial del dominio ZiF para facilitar la prestación eficiente y fácil de proteínas, y potencialmente más diversos tipos de macromoléculas, en las células.
Aquí, se presenta un protocolo detallado paso a paso sobre cómo implementar la tecnología ZiF para la entrega de proteínas en células de mamíferos. Anteriormente hemos construido un conjunto de uno, dos, tres, cuatro, cinco y seis dedo dominios ZIF que carecen de la capacidad de unirse al ADN, debido a la sustitución de cada uno de los residuos de unión a ADN-α helicoidal, pero son capaces de entregar proteínas en células 34 (Figura 1). Se describe la producción y la transducción de Emerald GFP (EmGFP) en células HeLa utilizando un dominio ZiF con dos dedos. Este protocolo es extensible a casi cualquier proteína capaz de la expresión soluble en Escherichia coli y casi cualquier tipo de célula de mamífero. Resultados esperados se proporcionan y también se discuten estrategias para maximizar el rendimiento de este sistema.
Aquí, se presenta un protocolo paso a paso para la entrega de proteínas utilizando zinc-finger (ZiF) dominios de células permeable. El dominio ZiF no reduce la actividad enzimática de la carga fundida 34; permite la producción y purificación de proteínas en rendimientos casi idénticos a los observados con proteína no modificada; y puede transportar proteínas y enzimas en una amplia gama de tipos de células con eficiencias que superan los sistemas de dominio de transducción de proteína o péptido …
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (DP1CA174426 a Carlos F. Barbas) y la Universidad ShanghaiTech, Shanghai, China (a JL). Se generaron gráficos moleculares utilizando PyMOL.
XmaI | New England Biolabs | R0180L | |
SacI | New England Biolabs | R0156L | |
Expand High Fidelity PCR system | Roche | 11759078001 | |
dNTPs | New England Biolabs | N0446S | |
4-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wells | Life Technologies | EC6028BOX | |
2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | 161-0737 | |
T4 DNA Ligase | Life Technologies | 15224-017 | |
BL21 (DE3) Competent E. coli | New England Biolabs | C2527I | |
IPTG | Thermo Scientific | R0391 | |
Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086-5G | |
Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-25 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-25G | |
DTT | Fisher Scientific | PR-V3151 | |
PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
Ni-NTA Agarose Resin | QIAGEN | 30210 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513-25G | |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMO Millipore | UFC900324 | |
DMEM | Life Technologies | 11966-025 | |
Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-028 | |
Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
24-Well Flat Bottom Plate | Sigma-Aldrich | CLS3527-100EA | |
Poly-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
DPBS, No Calcium, No Magnesium | Life Technologies | 21600010 | |
Heparan Sulfate | Sigma-Aldrich | H4777 | |
Trypsin | Life Technologies | 25300054 | |
Hela cells | ATCC | CCL-2 | |
Nano Drop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 |