Ex vivo Culture of Faryngeal Arches å studere Hjerte og Muscle stamfedre og deres nisje

Summary

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

Abstract

Svelg mesoderm av utviklings embryoer bidrar til brede regioner i hode og hjerte muskulatur. Vi har utviklet en ny metode for å studere hode og hjerte stamcelle utvikling med svelget buer (også kjent som branchial buer) ex vivo. Ved hjelp av denne metoden, har vi nylig beskrevet at andre svelg erke inneholder selvfornyende hjerte stamfedre og fungerer som en mikromiljøet for utvidelse av forfedrene under muse hjerte utvikling. De stamceller forblir udifferensiert og ekspansiv inne i buen, men raskt bli funksjonelle kardiomyocytter som de vandrer ut av buen. Vi rapporterte også at første svelget bue inneholder muskelstamfedre som gir opphav til myotubes etter forlate buen. Her demonstrerer vi prosedyren for disseksjon og ex vivo kultur av første og andre svelget buer fra utviklingsmuseembryoer. Metoden gjør det mulig å studere hode og hjerte stamfar / muskel development, inkludert cardiomyocyte og myotube dannelse i detalj ex vivo.

Introduction

Svelget mesoderm celler gi opphav til deler av hjertet og svelg muskler. Under embryonal utvikling, multipotente hjerte stamceller fra andre hjerte-feltet migrere fra svelget mesoderm og befolke hjerte utstrømningen veiene og høyre hjertekammer, og deres unormal utvikling er nært forbundet med medfødt hjertesykdom-den ledende årsak til fødselsskader og fødsel uten feil dødsfall hos mennesker ^1-3. Nyere studier har vist at svelget mesoderm bidrar til hodet muskler, i tillegg til hjertet, noe som gjør mesoderm en kritisk del av cardio-kraniofaciale utvikling ^4. Dermed utviklingsprosesser inkludert induksjon, spredning og differensiering av hode og hjerte stamfedre i svelg mesoderm er under aktiv etterforskning ^5-7.

Inntil nylig, forble det ukjent om hjerte stamceller gjennomgå utvidelse withoUT differensiering, delvis på grunn av mangel på informasjon om deres mobilmiljø. Vår fersk studie antyder at svelget buer tjene som en mikromiljøet for fornyelse av hjerte- og muskelstamfedre, og kan dyrkes ex vivo over flere uker ^8. Dette eksplantat metoden gir en ny og unik mulighet til å studere utviklingen av hjerte-kraniofacial stamfedre ex vivo.

Protocol

Alle mus ble opprettholdt på et American Association for akkreditering av Laboratory Animal Care (AAALAC) -accredited Dyreavdelingen ved Johns Hopkins University og plassert i samsvar med de prosedyrer som er skissert i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr. Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) godkjent alle eksperimentelle protokoller. 1. Experimental Forberedelse Coat 12-brønners plate med 10% føtalt bovint serum (FBS) i fosfat-bufret oppløsning (PBS) i 60 min. Fjern b…

Representative Results

Under utviklingen kan ansikts muskel og hjerte forfedre spores som de sprer og migrere fra 1. og 2. svelget bue, for å bli hode og hjerte muskulatur, henholdsvis (figur 1A, A 'og A' '). Dyrking svelget buer tilbyr en unik måte å studere hjerte og muskelutvikling i detalj ex vivo. Etter disseksjon og feste av svelg buer, kan migrere celler fra vedlagte buer observeres innen 24-48 timer av kultur. Innen 3 dager kultur myotube dannelse kan obse…

Discussion

I denne videoen viser vi hvordan å isolere og kultur første og andre svelget buer av 9,5 dager gamle museembryoer. Svelget buene er forbigående, segmentert buler som vises på craniolateral siden av utviklings embryo ^9, som inneholder flere potente hjerte stamceller-byggesteiner for å gjøre hjertet under embryogenese ^10,11 -i andre buer og hodet muskel forfedre i første buer ⁸ .

Disseksjon av svelget buer krever avanserte mus embryo disseksjon ferdighet…

Materials

FBS	Hyclone	SH30071.03
PBS + Ca2 + Mg2	Corning	21-030-CV
10cm petri plates	Fishersci	FB0875712
Scissor
Dissection forceps
Serum Free Media:
IMDM	Cellgro	15-016-CV
Ham’s F12	Cellgro	10-080-CV
N2-SUPPLEMENT	Gibco	17502-048
B27-retinoic acid	Gibco	12587-010
10% BSA (in PBS) à (Invitrogen Cat#. P2489)	Life Sciences	P2489
100X Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081)	Gibco	35050-61
100X Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063)	Gibco	15140-122