אקס תרבות Vivo של בלוע קשתות לחקר תאי אב לב ושרירים והנישה שלהם
Summary
Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.
Abstract
המזודרם בלוע של עוברים מתפתחים תורם לאזורים רחבים של ראש ושרירי לב. פיתחנו שיטה חדשה ללימוד פיתוח ראש ואב לב תא עם קשתות בלוע (הידוע גם בקשתות branchial) vivo לשעבר. באמצעות שיטה זו, שתארנו לאחרונה כי קשת בלוע השנייה מכילה אבות לב חידוש עצמיים ומשמשת כמייקרו-סביבה להרחבת האבות במהלך התפתחות לב עכבר. התאים שלא עברו התמיינות להישאר ורחב בתוך הקשת, אבל מהר מאוד הפכו cardiomyocytes הפונקציונלי כפי שהם נודדים מהקשת. אנחנו גם דיווחו כי קשת בלוע ראשונה מכילה אבות שריר והוליד myotubes לאחר שעזב את הקשת. הנה, אנחנו מדגימים את ההליך לנתיחה והתרבות לשעבר vivo של קשתות בלוע הראשונות ושנייה מפיתוח עוברי עכבר. השיטה מאפשרת לאדם ללמוד מוליד ראש והלב / dev שרירelopment, כולל cardiomyocyte והיווצרות myotube בפירוט vivo לשעבר.
Introduction
תאי המזודרם בלוע להצמיח חלקים של הלב ושרירי בלוע. במהלך התפתחות עוברית, תאי לב multipotent משדה הלב השני להגר מהמזודרם בלוע ולאכלס את דרכי יצוא לב וחדר ממני, וההתפתחות לא תקינה שלהם קשורה קשר הדוק עם מחלת לב מולדת-הגורם המוביל למומים מולדים ופגם לידה מקרי מוות הקשורים בבני האדם 1-3. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי המזודרם בלוע תורם לראש שרירים, בנוסף ללב, מה שהופך את המזודרם חלק קריטי בפיתוח סיבולת הלב-craniofacial 4. לפיכך, התהליכים התפתחותיים כוללים אינדוקציה, שגשוג, והבחנה של אבות ראש ולב בהמזודרם בלוע נמצאים תחת החקירה פעילה 5-7.
עד לאחרונה, הוא נשאר לא ידוע אם ותאי לב עוברים ללא ציפוי הרחבהבידול ut, נובע בחלקו חוסר המידע על הסביבה הסלולרית שלהם. המחקר שנערך לאחרונה שלנו מצביע על כך שקשתות בלוע לשמש כמייקרו-סביבה לחידוש של אבות לב ושרירים ויכולות להיות מתורבת לשעבר vivo על פני כמה שבועות 8. שיטת explant זה מציעה הזדמנות ייחודית וחדשנית ללימוד הפיתוח של אבות לב וcraniofacial vivo לשעבר.
Protocol
Representative Results
Discussion
בסרטון הזה, אנחנו מדגימים איך לבודד וקשתות התרבות הראשונה ובלוע השני של עוברי עכברים ישנים 9.5 ימים. קשתות בלוע הם חולפות, מפולחים בליטות המופיעות בצד craniolateral של עוברים מתפתחים 9, המכילים בלוקים אב תאים-בניין לב רב עוצמה כדי להפוך את הלב במהלך העובר 10,11 -in קשת…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Kwon laboratory members for helpful discussions. This work was supported by grants from NHLBI/NIH (R01HL111198) and Maryland Stem Cell Research Fund (MSCRF).
Materials
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| PBS + Ca2 + Mg2 | Corning | 21-030-CV | |
| 10cm petri plates | Fishersci | FB0875712 | |
| Scissor | |||
| Dissection forceps | |||
| Serum Free Media: | |||
| IMDM | Cellgro | 15-016-CV | |
| Ham’s F12 | Cellgro | 10-080-CV | |
| N2-SUPPLEMENT | Gibco | 17502-048 | |
| B27-retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| 10% BSA (in PBS) à (Invitrogen Cat#. P2489) | Life Sciences | P2489 | |
| 100X Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081) | Gibco | 35050-61 | |
| 100X Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063) | Gibco | 15140-122 | |
References
- Kelly, R. G. The second heart field. Curr Top Dev Biol. 100, 33-65 (2012).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451, 943-948 (2008).
- Tzahor, E., Evans, S. M. Pharyngeal mesoderm development during embryogenesis: implications for both heart and head myogenesis. Cardiovasc Res. 91, 196-202 (2011).
- Uosaki, H., et al. Direct Contact with Endoderm-like Cells Efficiently Induces Cardiac Progenitors from Mouse and Human Pluripotent Stem Cells. PLoS One. 7 (10), e46413 (2012).
- Cheng, P., et al. Fibronectin mediates mesendodermal cell fate decisions. Development. 140, 2587-2596 (2013).
- Kwon, C., et al. A regulatory pathway involving Notch1/beta-catenin/Isl1 determines cardiac progenitor cell fate. Nature cell biology. 11, 951-957 (2009).
- Shenje, L. T., et al. Precardiac deletion of Numb and Numblike reveals renewal of cardiac progenitors. Elife. 3, e02164 (2014).
- Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Semin Cell Dev Biol. 21, 325-332 (2010).
- Kwon, C., Cordes, K. R., Srivastava, D. Wnt/beta-catenin signaling acts at multiple developmental stages to promote mammalian cardiogenesis. Cell Cycle. 7, 3815-3818 (2008).
- Cho, G. S., Fernandez, L., Kwon, C. Regenerative medicine for the heart: perspectives on stem-cell therapy. Antioxid Redox Signal. 21, 2018-2031 (2014).
