Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.
Генный Синтетические дрожжи (Sc2.0) направлен на создание 16 дизайнерские дрожжей хромосом и объединить их в один дрожжевой клетки. На сегодняшний день один синтетическую хромосому, synIII 1, и один синтетический руку хромосом, synIXR 2, были построены и их функции в естественных подтверждено при отсутствии соответствующих диких хромосом типа. Важно особенностью дизайна Sc2.0 хромосом введение PCRTags, которые короткие, перекодируются последовательности в пределах открытых рамок считывания (ORFs), которые позволяют дифференцировать синтетических хромосом от своих диких аналогов типа. PCRTag праймеров отжига избирательно либо синтетических или диких хромосом типа и наличия / отсутствия каждого типа ДНК могут быть проверены с помощью простого ПЦР. Стандарт считывание PCRTag анализа заключается в оценке наличия / отсутствия ампликонов с помощью электрофореза в агарозном геле. Тем не менее, со средней плотностью PCRTag ампликон одного за 1,5 кб и AGenome размер ~ 12 Мб, завершена Sc2.0 геном кодирует примерно 8000 PCRTags. Для повышения пропускной способности, мы разработали ПЦР в реальном времени на основе анализа обнаружения для PCRTag генотипирования, что мы называем анализ qPCRTag. Рабочий процесс указывает, 500 NL реакции в 1536 многоямного пластины, что позволяет нам испытать до 768 PCRTags с синтетическими и диких пар типа праймеров в одном эксперименте.
Sc2.0 или Генный Синтетические дрожжи ( www.syntheticyeast.org ), поставила перед собой цель проектирования и построения полностью синтетический геном эукариотической. Использование высоко куратором генома последовательности Saccharomyces CEREVISIAE 3 в качестве отправной точки, каждая из шестнадцати линейных хромосом был вновь создан, чтобы удовлетворить набор принципов проектирования, определяющих сохранение клеток фитнес, улучшение стабильности генома и повышения генетического гибкость. Например, дестабилизирующие элементы, такие как повторы удаляются из Sc2.0 хромосом. Все экземпляры TAG стоп-кодонов повторно закодированы, чтобы ТАА на "освободить" кодон в конечном штамма для введения негенетически закодированной аминокислоты. Кроме того, индуцируемый эволюция системы, карабкаться, включен в систему Cre-LOX, позволяет беспрецедентный способность генерировать производные геномы с новыми конструкций 4.
<p class="Jove_content"> Еще одним важным элементом дизайна в Sc2.0 генома введение PCRTags, которые служат в качестве водяных знаков ДНК для того, чтобы отслеживать и синтетических ДНК дикого типа. PCRTags короткие, перекодируются сегменты ОРС на синтетических хромосом; в то время как последовательности PCRTag различаются на уровне ДНК между синтетическими и диких хромосом типа, кодируемые белки идентичны по аминокислотной последовательности и, таким образом, предположительно, функции. Последовательности PCRTag специально разработан как сайты связывания праймеров для облегчения селективного усиления (рис 1А). PCRTag конструкции осуществляется с помощью '' самых разных алгоритма в GeneDesign 5,6, получая перекодировать синтетические последовательности, которые, как правило, ~ 60% отличается от нативных последовательностей (минимум 33%) с температурой плавления от 58 ° С до 60 ° С и длина ампликон между 200-500 пар оснований 2. Перекодирования не допускается в течение первых 100 п.н. каждого ORF, так как эти области, как известно,есть специальные предпочтения в плане использования кодонов 7. Вместе, эти правила проектирования пользу высокой производительности почти все PCRTags под одного набора ПЦР условиях, когда синтетические и дикие пары типа PCRTag праймеров исключительно связывают и усиливают синтетического и нативной ДНК, соответственно (рис 1B).
Рисунок 1:. PCRTag принципиальная (A) PCRTags повторно закодированы последовательности в открытых рамок считывания (ORF) генов на хромосомах Sc2.0. (Б) Синтетический (SYN) и дикого типа (WT) PCRTag праймеры исключительно связывать и амплификации синтетического и дикого типа геномной ДНК (GDNA), соответственно. Здесь показан анализ кб сегменте левого плеча хромосомы шесть ~ 30, тестирование тринадцать PCRTag пары праймеров, используя либо WT или полу-synVIL2 GDNA в качестве шаблона. Во многих случаях один ORF кодирует более одного PCRTag. Наличие / отсутствие PCRTag ампликонов оценивают с помощью электрофореза в агарозном геле. PCRTag ампликоны варьируются в размерах от 200 до 500 б.п. ВР. Чем быстрее мигрирующие виды в нижней части панелей праймеров димеры.
Анализ PCRTag оказалась важным инструментом в сборке Sc2.0 хромосом. В типичном эксперименте 30-50 т.п.н. из синтетической ДНК, кодирующей 20-30 PCRTags, превращается в дрожжевых клетках, чтобы заменить соответствующий ДНК дикого типа 1,2,8. Анализ PCRTag затем используется для идентификации трансформантов, которые кодируют синтетические, но не дикий PCRTags типа, охватывающие этот сегмент ДНК, или так называемые «победители». Это, как правило, необходимо протестировать несколько трансформантов для выявления «победителей», так пропускной и стоимость анализа PCRTag важные соображения. В настоящее время два Sc2.0 хромосомы были завершены (synIII 1 и synIXR 2), что составляет менее 10% от Sc2.0 генома, альтHough более половины оставшихся хромосом в настоящее время проходят синтез и сборку. Масштаб анализа PCRTag требуется для этого проекта быстро опережает способность управлять гели и вручную набрать наличие синтетической ДНК и отсутствие ДНК дикого типа.
Для улучшения пропускной способности анализа PCRTag мы разработали технологический процесс, используя ПЦР в реальном времени, чтобы обойти использование электрофореза на агарозном геле. Рабочий процесс использует объемной дозатора жидкости, чтобы распределить КПЦР Mastermix в каждую лунку 1536 многоямного пластины, наноразмерных акустических жидкости дозатора переноса ДНК матрицы и праймеров, и 1536 КПЦР термоциклер, что позволяет нам миниатюризации реакции до 500 п и увеличить пропускную способность. Кроме того анализ может быть автоматизирован. Этот тип протокола генотипирования высокой пропускной должны быть обобщены к любому проекту, требующей анализа многих клонов на нескольких локусов.
Включение в режиме реального времени обнаружения ПЦР в генотипирования анализа PCRTag является важным событием для проекта Sc2.0, поскольку это позволяет значительно более высокую пропускную способность. Предыдущая рабочий указано 2,5 мкл реакции в 384 луночных ПЦР планшет, 1,5 ч время термоциклирования перспективе, электрофореза в агарозном геле, и руководство аннотаций геля.
Рабочий, представленные здесь, называется анализ qPCRTag, преодолевает несколько крупных узких мест. Во-первых, qPCRTag выполнения конденсируется 4 х 384-луночных в одном эксперименте, который может быть обработан, от начала до конца (пластины, установленной на плюс время выполнения), примерно в час. Важно отметить, что стоимость реагента в каждую лунку для анализа qPCRTag находится на одном уровне с нижней пропускной подхода в агарозном геле на основе. Тем не менее, в обход гель-электрофореза и ручной аннотации, рабочий qPCRTag дает существенную экономию во времени и труда, которые являются основными преимуществами. Важно рабочий qPCRTag есть ваннаяtirely совместим с автоматизацией.
Одной из основных проблем при использовании обнаружения реального времени, как на выходе анализа PCRTag является скорость ложных срабатываний и ложных негативов. Поскольку PCRTag праймеры не были первоначально предназначены для использования в ПЦР в реальном времени, можно ожидать, что не все пары праймеров будет подходящим для использования с этой продукции. Для этого важно, чтобы проверить функции и специфику всех пар праймеров PCRTag исключить подмножество, которые не работают в реальном времени на основе анализа фронт. Например, хромосома 3 PCRTag ложных срабатываний и негативы по-и-большой воспроизводимая в режиме реального времени данные ПЦР (2 и 3), и они могут быть исключены из дальнейшего анализа. Кроме того, пары праймеров, известных неудачу (оценивали с помощью гель-электрофореза и показанный на фиг S6 и S7 на Annaluru др. 1) также может быть исключена. Это легко сделать, просто excluДин неисправные пары праймеров при настройке протокола акустической передачи.
Как и большинство высокопроизводительных анализов, мы намерены использовать обнаружение PCRTag в режиме реального времени в качестве основного экрана, чтобы определить трансформантов, которые заслуживают дальнейшего вниз по течению проверки. Впоследствии, золотым стандартом для среднего скрининга останется PCRTag анализ с помощью гель-электрофореза в качестве отсчета. За применение анализа PCRTag для Sc2.0, сочетая государством в самых современных систем обработки наноразмерных жидкость с высокой пропускной реального времени ПЦР-технологии позволяет быстро и автоматизированный анализ и имеет потенциал, чтобы влиять на многие поля. Например, это рабочий процесс может быть применен к высокой пропускной скрининга библиотеки, инфекционного заболевания, диагноз анализа микробиомом и передовые подходы редактирования генома попытке изменить несколько локусов одновременно.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была частично поддержана Национальным научным фондом Грант MCB-0718846 и перспективных исследований Министерства обороны Агентский договор N66001-12-C-4020 (для JDB). ЛАМ финансировалась докторантуру из естественных наук и инженерного исследовательский совет Канады. Публикация этой статьи авторами Roche.
Yeast gDNA prep | |||
yeast gDNA | custom | custom | template for real time PCR |
Acid-washed glass beads (0.5mm) | Sigma | G8772 | yeast cell lysis |
Ultrapure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v) | Invitrogen | 15593-031 | yeast cell lysis |
5432 Mixer | Eppendorf | 5432 | yeast cell lysis |
Microcentrifuge 5417R | Eppendorf | 22621807 | yeast cell lysis |
Qubit 3.0 Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | gDNA quantification |
Qubit dsDNA BR Assay Kit | Life Technologies | Q32850 | gDNA quantification |
Labcyte 384PP plate | Labcyte | P-05525 | gDNA source plate |
DNA Green Mastermix prep and dispensing | |||
LightCycler 1536 DNA Green | Roche | 5573092001 | real time PCR mastermix |
1.5mL Microfuge Tube Holder | ARI | EST BD060314-1 | microfuge tube holder for deck of Cobra |
LightCycler 1536 Multiwell Plate | Roche | 5358639001 | |
Cobra liquid handling system | Art Robbins Instruments | 630-1000-10 | dispense qPCR master mix into 1536 plate |
PCR Plate Spinner | VWR | 89184-608 | cenrifugation of 1536 plate |
Template and primer dispensing | |||
PCRTag primers | IDT | custom | premixed forward and reverse, [50uM] each |
TempPlate pierceable sealing foil, sterile | USA Scientific | 2923-0110 | temporary seal for PCRTag primer plates |
Labcyte LDV 384 well plate | Labcyte | LP-0200 | pre-mixed primer source plate |
Echo 550 Liquid Handler | Labcyte | transfer 2.5nL drops of primer and template DNA into 1536 plate | |
Plateloc Thermal Microplate Sealer | Agilent | G5402-90001 | heat seal for 1536 plate prior to LC1536 run |
Clear Permanent Seal | Agilent | 24212-001 | optically clear heat seal for LC1536 multiwell plate |
PlateLoc Roche/LightCycler 1536 Plate Stage | Agilent | G5402-20008 | can substitute ~2mm thick washers |
Sorvall Legend XTR | Thermo Scientfic | 75-004-521 | centrifuge heat sealed 1536 plate |
Industrial Air Compressor | Jun Air | 1795011 | to run the Echo and Heat Sealer |
Real Time PCR | |||
LightCycler 1536 | Roche | requires 220V outlet |