We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.
Membraan receptor-ligand-interacties mediëren vele cellulaire functies. Bindingskinetiek en downstream signalering veroorzaakt door deze moleculaire interacties worden waarschijnlijk beïnvloed door de mechanische omgeving waarin binding en signalering plaatsvinden. Een recente studie toonde aan dat mechanische kracht antigen herkenning door kunnen regelen en activeren van de T-celreceptor (TCR). Dit werd mogelijk gemaakt door een nieuwe technologie die we ontwikkeld en genoemd fluorescentie biomembraan kracht sonde (fBFP), die single-molecule kracht spectroscopie gecombineerd met fluorescentiemicroscopie. Met behulp van een ultra-soft menselijke rode bloedcellen als gevoelige krachtsensor, een high-speed camera en real-time imaging volgtechnieken, de fBFP is ~ 1 pN (10 -12 N) ~ 3 nm tot ~ 0,5 msec kracht, ruimtelijke en temporele resolutie. Met de fBFP, kan men precies enkele receptor-ligand bindingskinetiek onder dwang regelgeving en tegelijkertijd het binding-geactiveerd intracellulaire cal metenCium signalering op een enkele levende cellen. Deze nieuwe technologie kan worden gebruikt om andere membraan receptor-ligand interactie en signalering bestuderen andere cellen onder mechanische regeling.
Cel-cel en cel-extracellulaire matrix (ECM) adhesie wordt gemedieerd door binding tussen celoppervlakreceptoren ECM proteïnen, en / of lipiden 1. Binding cellen mogelijk maakt functionele structuur 1 vormen, alsmede erkennen communiceren, en reageren op de omgeving 1-3. Unlike oplosbare proteïnen (bijvoorbeeld cytokines en groeifactoren) die binden van een driedimensionaal (3D) vloeistoffase op het celoppervlak receptoren, celadhesie receptoren vormen banden met hun liganden over een smalle spleet junctie met twee tegenover elkaar gelegen oppervlakken die moleculaire beperken overbruggen diffusie in een dimensionale (2D) interface van 4-7 twee. In tegenstelling tot 3D kinetiek die vaak worden gemeten met traditionele binding assays (bijvoorbeeld oppervlakte plasmon resonantie of SPR), 2D kinetiek te kwantificeren met gespecialiseerde technieken zoals atomaire kracht microscopie (AFM) 10/08, stromingskamerinfusie 11,12, micropipet 13,14, optischepincet 15 en biomembraan kracht sonde (BFP) 16-21.
Meer dan louter fysieke koppeling verschaffen voor mobiele samenhang adhesiemoleculen zijn een belangrijke component van de signalering machines voor de cel te communiceren met de omgeving. Er is toenemende belangstelling voor het begrip hoe ligand betrokkenheid van adhesiemoleculen initieert intracellulaire signalering en hoe de eerste signaal wordt getransduceerd in de cel geweest. Intuïtief, eigenschappen van receptor-ligand binding kan invloed hebben op de signalen induceert. Het is echter moeilijk om mechanistische relaties tussen de extracellulaire en intracellulaire interactie signaleringsgebeurtenissen ontleden met traditionele ensemble van biochemische assays vanwege de vele beperkingen, zoals een slechte tijdsresolutie en het totale gebrek aan ruimtelijke resolutie. Bestaande methoden die zowel biofysische (2D receptor-ligand bindingskinetiek) toestaan en biochemische (signalering) opmerkingen over live-cellen omvatten substraten van instelbare stijfheid 22, elastomeer pijler arrays 23 en stroom kamer / microfluïdische apparaten opgenomen met fluorescentie vermogen 24-26. Echter, uitlezingen van signalering en receptor-ligand binding hebben (meestal door verschillende mogelijkheden) afzonderlijk te verkrijgen, waardoor het moeilijk om temporele en ruimtelijke relaties van obligatiekenmerken met signalerende gebeurtenissen ontleden.
Conventionele BFP is een ultragevoelige kracht spectroscopie met hoge spatiotemporele resolutie 17. Het maakt gebruik van een flexibele rode bloedcellen (RBC) als een kracht sensor, waardoor de meting van de single-molecule 2D-kinetiek, mechanische eigenschappen en conformationele veranderingen 14,16,19-21,27-29. Een fluorescerende beeldvorming gebaseerd BFP (fBFP) correleert de receptor-ligand binding kinetiek met de bindende geactiveerd cell signaling in single-molecule schaal. Met deze opstelling, in situ cell signaling-activiteiten in het kader van het oppervlak mechanical stimulering werd waargenomen in T-cellen 27. De fBFP is veelzijdig en kan worden gebruikt voor onderzoek naar celadhesie en signalering gemedieerd door andere moleculen in andere cellen.
Een succesvolle fBFP experiment brengt een paar kritische overwegingen. Ten eerste, voor de berekening van krachten betrouwbaar zijn, de micropipet, de RBC en de probe hiel moet worden afgestemd coaxiaal zo dicht mogelijk. De projectie van de RBC in de pipet moet ongeveer één probe pipet diameter zodat de wrijving tussen de RBC en de pipet verwaarloosbaar. Voor een typische humane RBC, de optimale pipet diameter 2,0-2,4 urn, waarbij een beste passing van vergelijking 1 17,30 oplevert. Ten tweede, om te waar…
The authors have nothing to disclose.
Research related to this paper and the development of the fBFP technology in the Zhu lab were supported by NIH grants AI044902, AI077343, AI038282, HL093723, HL091020, GM096187, and TW008753. We thank Evan Evans for inventing this empowering experimental tool, and members of the Evans lab, Andrew Leung, Koji Kinoshita, Wesley Wong, and Ken Halvorsen, for helping us to build the BFP. We also thank other Zhu lab members, Fang Kong, Chenghao Ge and Kaitao Li, for their helps in the instrumentation development.
Table 1: Reagents/Equipment | |||
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4•H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | N2-5% buffer preparation |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | N2-5% buffer preparation |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | N2-5% buffer preparation |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | N2-5% buffer preparation |
MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Bead functionalization |
Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
Nystatin | Sigma-Aldrich | N6261 | RBC osmolarity adjustment |
Ammonium Hydroxide (NH4OH) | Sigma-Aldrich | A-6899 | Glass bead silanization |
Methanol | BDH | 67-56-1 | Glass bead silanization |
30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | J. T. Barker | Jan-86 | Glass bead silanization |
Acetic Acid (Glacial) | Sigma-Aldrich | ARK2183 | Glass bead silanization |
3-MERCAPTOPROPYLTRIMETHOXYSILANE(MPTMS) | Uct Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology | 9002 | Glass bead functionalization |
Streptavidin−Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
Fura2-AM | Life Technologies | F-1201 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
Flow Cytometer | BD Biosciences | BD LSR II | Density quantification |
Capillary Tube 0.7-1.0mm x 30" | Kimble Chase | 46485-1 | Micropipette making |
Flaming/Brown Micropipette Puller | sutter instrument | P-97 | Micropipette making |
Pipette microforce | Narishige | MF-900 | Micropipette making |
Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
Micro-injector | World Precision Instruments | MF34G-5 | Chamber assembly |
1ml Syringe | BD | 309602 | Chamber assembly |
Micropipette holder | Narishige | HI-7 | Chamber assembly |
Home-designed mechanical parts and adaptors fabrications using CNC machining. | Biophysics Instrument | All parts are customized according to the CAD designs. | BFP system |
Microscope (TiE inverted) | Nikon | MEA53100 | BFP system |
Objective CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72mm, Spg) | Nikon | MRH00401 | BFP system |
Camera, GE680, 640×480, GigE, 1/3" CCD, mono | Graftek Imaging | 02-2020C | BFP system |
Prosilica GC1290 – ICX445, 1/3", C-Mount, 1280×960, Mono., CCD, 12 Bit ADC | Graftek Imaging | 02-2185A | BFP system |
Manual submicron probehead with high resolution remote control | Karl Suss | PH400 | BFP system |
Anti-vibration table (5’ x 3’) | TMC | 77049089 | BFP system |
3D manual translational stage | Newport | 462-XYZ-M | |
SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2012 SP5 | BFP system |
LabVIEW software | National Instruments | Version 2009 | BFP system, BFP program |
3D piezo translational stage | Physik Instrumente | M-105.3P | BFP system |
Linear piezo accuator | Physik Instrumente | P-753.1CD | BFP system |
Micromanager software | Version 1.4 | fBFP system, fluorescence imaging program | |
Dual Cam (DC-2) | Photometrics | 77054724 | fBFP system |
Dual Cam emission filter (T565LPXR) | Photometrics | 77054725 | fBFP system |
Fluorescence Camera | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600-10B | fBFP system |
Plastic paraffin film (Parafilm) | Bemis Company, Inc | PM996 | bottle sealing |
Table 2: Buffer solutions | |||
Carbonate/bicarbonate buffer (pH 8.5) | |||
Sodium Carbonate (Na2CO3) | 8.4g/L | ||
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | 10.6g/L | ||
Phosphate buffer (pH 6.5-6.8) | |||
NaPhosphate monobasic NaH2PO4•H2O | 27.6g/L | ||
Anhy. NaPhosphate dibasic Na2HPO4 | 28.4g/L | ||
N2-5% buffer (pH 7.2) | |||
Potassium chloride (KCl) | 20.77g/L | ||
Sodium chloride (NaCl) | 2.38g/L | ||
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | 0.13g/L | ||
Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | 0.71g/L | ||
Sucrose | 9.70g/L |