Флуоресценции зонда биомембрана Сила: Параллельное Количественное рецептор-лиганд кинетики и привязка вызванной внутриклеточной сигнализации на одну ячейку
Summary
We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.
Abstract
Рецептор-лиганд Мембранные опосредуют многие клеточные функции. Переплет кинетика и вниз по течению сигнализации вызвано этих молекулярных взаимодействий, вероятно, зависит от механической среды, в которой обязательными и сигнализации состоится. Недавнее исследование показало, что механическая сила может регулировать признание антигена и запуск Т-клеточного рецептора (TCR). Это стало возможным благодаря новой технологии мы разработали и называется флуоресценции зонда биомембрана силы (fBFP), который сочетает в себе одной молекулы силовой спектроскопии с флуоресцентной микроскопии. Использование ультра-мягкой эритроцит человека как чувствительный датчик силы, высокоскоростной камеры и в режиме реального времени методы отслеживания изображения, fBFP имеет ~ 1 PN (10 -12 Н), ~ 3 нм и ~ 0,5 мсек сила, пространственное и временное разрешение. С fBFP, можно точно измерить отдельные рецептор-лиганд кинетики связывания под регулирования силы и одновременно изображение связывание-срабатывает внутриклеточный калбилирубина сигнализации на одном живой клетке. Эта новая технология может быть использована для изучения другой рецептор-лиганд и мембраны сигналов в других ячейках, при механическом регулировании.
Introduction
Клетка-клетка и клетка-к-внеклеточного матрикса (ЕСМ) адгезия опосредуется связыванием между рецепторами клеточной поверхности, ECM белков, и / или липидов 1. Связывание позволяет клеткам с образованием функциональных структур 1, а также признать, общаться и реагировать на окружающую среду 1-3. В отличие растворимых белков (например, цитокины и факторы роста), которые связывают с трехмерной (3D) жидкой фазы на рецепторы клеточной поверхности, адгезии клеток рецепторы образовывать связи с их лигандами через узкий зазор соединительного по преодолению две противоположные поверхности, которые ограничивают молекулярную диффузии в размерном интерфейса 4-7 двух (2D). В отличие от 3D кинетики, которые обычно измеряется с помощью традиционных анализов связывания (например, поверхностного плазмонного резонанса или SPR), 2D кинетики должны быть количественно специализированных методов, таких как атомно-силовой микроскопии (АСМ) 8-10 камеру 11,12 течь, микропипетка 13,14, оптическийпинцет 15 и биомембрана силы зонд (ДЦ) 16-21.
Больше, чем просто обеспечение физической связи для сотовых сплоченности, молекулы адгезии являются основным компонентом техники сигнализации для ячейки, чтобы общаться с его окружением. Там было все больший интерес в понимании того, как лиганд взаимодействие молекул адгезии инициирует внутриклеточную передачу сигнала и, как начальный сигнал трансдуцированных внутри клетки. Интуитивно, свойства рецептор-лиганд связывания может повлиять сигналы, которые он индуцирует. Тем не менее, трудно анализировать механистические отношения между внеклеточной взаимодействия и внутриклеточных сигнальных событий с использованием традиционного ансамбль биохимических анализов из-за своих многочисленных ограничений, например, бедной временным разрешением и полным отсутствием пространственным разрешением. Существующие методы, которые позволяют как биофизический (2D рецептор-лиганд кинетики связывания) и биохимические (сигнализации) замечания по живойклетки включают субстраты перестраиваемой жесткости 22, резина столба массивов 23 и проточная камера / микрожидкостных устройства включены с флуоресцентной способности 24-26. Тем не менее, показания сигнализации и рецептор-лиганд связывания должны быть получены отдельно (чаще различными методами), что делает его трудно анализировать временные и пространственные соотношения характеристик связь с сигнальных событий.
Обычные ДЦ является сверхчувствительного силовая спектроскопия с высоким пространственно-временным разрешением 17. Он использует гибкую эритроцит (РБК) в качестве датчика силы, что позволяет измерять одной молекулы 2D кинетики, механических свойств и конформационных изменений 14,16,19-21,27-29. На основе люминесцентных изображений ДЦ (fBFP) коррелирует рецептор-лиганд кинетики связывания с обязательной-клеточной сигнализации срабатывает при масштабе одной молекулы. С этой установкой, деятельности сигнальных Ситу клеток в в контексте поверхностных mechaniкал стимуляции наблюдалось в Т-клетках 27. FBFP является универсальным и может быть использован для изучения адгезии и клеточной сигнализации, опосредованные другими молекулами в других клетках.
Protocol
Representative Results
Discussion
Успешный эксперимент fBFP влечет за собой несколько важных соображений. Во-первых, для расчета силы, чтобы быть надежным, микропипетка, РБК, и зонд шарик должен быть выровнен как можно ближе к коаксиальному как это возможно. Проекция RBC внутри пипетки должны быть примерно одного диаметра ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research related to this paper and the development of the fBFP technology in the Zhu lab were supported by NIH grants AI044902, AI077343, AI038282, HL093723, HL091020, GM096187, and TW008753. We thank Evan Evans for inventing this empowering experimental tool, and members of the Evans lab, Andrew Leung, Koji Kinoshita, Wesley Wong, and Ken Halvorsen, for helping us to build the BFP. We also thank other Zhu lab members, Fang Kong, Chenghao Ge and Kaitao Li, for their helps in the instrumentation development.
Materials
| Table 1: Reagents/Equipment | |||
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4•H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
| Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | N2-5% buffer preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | N2-5% buffer preparation |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | N2-5% buffer preparation |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | N2-5% buffer preparation |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Bead functionalization |
| Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
| Nystatin | Sigma-Aldrich | N6261 | RBC osmolarity adjustment |
| Ammonium Hydroxide (NH4OH) | Sigma-Aldrich | A-6899 | Glass bead silanization |
| Methanol | BDH | 67-56-1 | Glass bead silanization |
| 30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | J. T. Barker | Jan-86 | Glass bead silanization |
| Acetic Acid (Glacial) | Sigma-Aldrich | ARK2183 | Glass bead silanization |
| 3-MERCAPTOPROPYLTRIMETHOXYSILANE(MPTMS) | Uct Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
| Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology | 9002 | Glass bead functionalization |
| Streptavidin−Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
| BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
| Fura2-AM | Life Technologies | F-1201 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
| Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | BD LSR II | Density quantification |
| Capillary Tube 0.7-1.0mm x 30" | Kimble Chase | 46485-1 | Micropipette making |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | sutter instrument | P-97 | Micropipette making |
| Pipette microforce | Narishige | MF-900 | Micropipette making |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
| Micro-injector | World Precision Instruments | MF34G-5 | Chamber assembly |
| 1ml Syringe | BD | 309602 | Chamber assembly |
| Micropipette holder | Narishige | HI-7 | Chamber assembly |
| Home-designed mechanical parts and adaptors fabrications using CNC machining. | Biophysics Instrument | All parts are customized according to the CAD designs. | BFP system |
| Microscope (TiE inverted) | Nikon | MEA53100 | BFP system |
| Objective CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72mm, Spg) | Nikon | MRH00401 | BFP system |
| Camera, GE680, 640×480, GigE, 1/3" CCD, mono | Graftek Imaging | 02-2020C | BFP system |
| Prosilica GC1290 – ICX445, 1/3", C-Mount, 1280×960, Mono., CCD, 12 Bit ADC | Graftek Imaging | 02-2185A | BFP system |
| Manual submicron probehead with high resolution remote control | Karl Suss | PH400 | BFP system |
| Anti-vibration table (5’ x 3’) | TMC | 77049089 | BFP system |
| 3D manual translational stage | Newport | 462-XYZ-M | |
| SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2012 SP5 | BFP system |
| LabVIEW software | National Instruments | Version 2009 | BFP system, BFP program |
| 3D piezo translational stage | Physik Instrumente | M-105.3P | BFP system |
| Linear piezo accuator | Physik Instrumente | P-753.1CD | BFP system |
| Micromanager software | Version 1.4 | fBFP system, fluorescence imaging program | |
| Dual Cam (DC-2) | Photometrics | 77054724 | fBFP system |
| Dual Cam emission filter (T565LPXR) | Photometrics | 77054725 | fBFP system |
| Fluorescence Camera | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600-10B | fBFP system |
| Plastic paraffin film (Parafilm) | Bemis Company, Inc | PM996 | bottle sealing |
| Table 2: Buffer solutions | |||
| Carbonate/bicarbonate buffer (pH 8.5) | |||
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | 8.4g/L | ||
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | 10.6g/L | ||
| Phosphate buffer (pH 6.5-6.8) | |||
| NaPhosphate monobasic NaH2PO4•H2O | 27.6g/L | ||
| Anhy. NaPhosphate dibasic Na2HPO4 | 28.4g/L | ||
| N2-5% buffer (pH 7.2) | |||
| Potassium chloride (KCl) | 20.77g/L | ||
| Sodium chloride (NaCl) | 2.38g/L | ||
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | 0.13g/L | ||
| Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | 0.71g/L | ||
| Sucrose | 9.70g/L | ||
Riferimenti
- Aplin, A. E., Howe, A., Alahari, S. K., Juliano, R. L. Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins. Pharmacological reviews. 50, 197-263 (1998).
- Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
- Dado, D., Sagi, M., Levenberg, S., Zemel, A. Mechanical control of stem cell differentiation. Regenerative medicine. 7, 101-116 (2012).
- Edwards, L. J., Zarnitsyna, V. I., Hood, J. D., Evavold, B. D., Zhu, C. Insights into T cell recognition of antigen: significance of two-dimensional kinetic parameters. Frontiers in immunology. 3, 86 (2012).
- Zhu, C., Jiang, N., Huang, J., Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D. Insights from in situ analysis of TCR-pMHC recognition: response of an interaction network. Immunological reviews. 251, 49-64 (2013).
- Huang, J., Meyer, C., Zhu, C. T. T cell antigen recognition at the cell membrane. Molecular immunology. 52, 155-164 (2012).
- Zarnitsyna, V., Zhu, C. T. T cell triggering: insights from 2D kinetics analysis of molecular interactions. Physical biology. 9, 045005 (2012).
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).
- Marshall, B. T., et al. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423, 190-193 (2003).
- Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. The Journal of cell biology. 185, 1275-1284 (2009).
- Yago, T., et al. Catch bonds govern adhesion through L-selectin at threshold shear. The Journal of cell biology. 166, 913-923 (2004).
- Yago, T., et al. Platelet glycoprotein Ibalpha forms catch bonds with human WT vWF but not with type 2B von Willebrand disease vWF. The Journal of clinical investigation. 118, 3195-3207 (2008).
- Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette. Biophysical journal. 75, 1553-1572 (1998).
- Huang, J., et al. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464, 932-936 (2010).
- Heinrich, V., Wong, W. P., Halvorsen, K., Evans, E. Imaging biomolecular interactions by fast three-dimensional tracking of laser-confined carrier particles. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 24, 1194-1203 (2008).
- Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations. Biophysical journal. 94, 694-701 (2008).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces. Biophysical. 68, 2580-2587 (1995).
- Evans, E., Leung, A., Heinrich, V., Zhu, C. Mechanical switching and coupling between two dissociation pathways in a P-selectin adhesion bond. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11281-11286 (2004).
- Ju, L., Dong, J. -. f., Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal Flanking Region of the A1 Domain Regulates the Force-dependent Binding of von Willebrand Factor to Platelet Glycoprotein Ib. Journal of Biological Chemistry. 288, (2013).
- Chen, W., Lou, J., Zhu, C. Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds. The Journal of biological chemistry. 285, 35967-35978 (2010).
- Chen, W., Lou, J., Evans, E. A., Zhu, C. Observing force-regulated conformational changes and ligand dissociation from a single integrin on cells. The Journal of cell biology. 199, 497-512 (2012).
- Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophysical journal. 102, L5-L7 (2012).
- Bashour, K. T., et al. CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2241-2246 (2014).
- Nesbitt, W. S., et al. Distinct glycoprotein Ib/V/IX and integrin alpha IIbbeta 3-dependent calcium signals cooperatively regulate platelet adhesion under flow. The Journal of biological chemistry. 277, 2965-2972 (2002).
- Mazzucato, M., Pradella, P., Cozzi, M. R., De Marco, L., Ruggeri, Z. M. Sequential cytoplasmic calcium signals in a 2-stage platelet activation process induced by the glycoprotein Ibalpha mechanoreceptor. Blood. 100, 2793-2800 (2002).
- Lefort, C. T., Ley, K. Neutrophil arrest by LFA-1 activation. Frontiers in immunology. 3, 157 (2012).
- Liu, B., Chen, W., Evavold, B. D., Zhu, C. Accumulation of dynamic catch bonds between TCR and agonist peptide-MHC triggers T cell signaling. Cell. 157, 357-368 (2014).
- Lou, J., et al. Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge. The Journal of cell biology. 174, 1107-1117 (2006).
- Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex. Nature communications. 5, 4886 (2014).
- Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods. Cellular and molecular bioengineering. 1, 276-288 (2008).
- Marshall, B. T., Sarangapani, K. K., Lou, J., McEver, R. P., Zhu, C. Force history dependence of receptor-ligand dissociation. Biophysical. 88, 1458-1466 (2005).
- Xiang, X., et al. Structural basis and kinetics of force-induced conformational changes of an alphaA domain-containing integrin. PloS one. 6, e27946 (2011).
