Floresan biyomembran Kuvvet Probe: Tek Hücre üzerinde Reseptör-ligand Kinetiklerinin Eşzamanlı kantitasyonu ve Bağlama kaynaklı Hücre içi Sinyal
Summary
We describe a technique for concurrently measuring force-regulated single receptor-ligand binding kinetics and real-time imaging of calcium signaling in a single T lymphocyte.
Abstract
Membran reseptör-ligand etkileşimleri, birçok hücresel fonksiyona aracılık eder. Bağlama kinetik ve bu moleküler etkileşimler tarafından tetiklenen aşağı sinyal muhtemelen mekanik ortamda bağlayıcı ve sinyal almak yeri etkilenir. Yeni bir çalışmada, mekanik kuvvet ile, antijen tanıma düzenleyen ve T-hücre reseptör (TCR) tetiklenmesi göstermiştir. Bu floresan mikroskobu ile tek-molekül kuvvet spektroskopisi birleştiren yeni geliştirdiğimiz teknoloji ve Vadeli floresan biyomembran kuvvet probu (fBFP), ile mümkün olmuştur. Hassas kuvvet sensörü gibi yüksek hızlı kamera ve gerçek zamanlı görüntüleme izleme teknikleri ultra yumuşak insan kırmızı kan hücresi kullanılarak, fBFP ~ 1 pN (10 -12 N), ~ 3 nm ve ~ 0.5 milisaniye içinde kuvvet, uzaysal ve zamansal çözünürlük. FBFP ile bir tam kuvvet yönetmelik kapsamında tek reseptör-ligand bağlanma kinetiği ve aynı zamanda görüntü tetiklenen bağlayıcı hücre içi cal ölçebilirsinizkalsiyum içeren tek bir canlı hücre sinyal. Bu yeni teknoloji, mekanik düzenleme altında, diğer hücrelerde diğer membran reseptörü-ligand etkileşimini ve sinyal incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Hücre-hücre ve hücre-hücre dışı matris (ECM) yapışma, hücre yüzeyi reseptörleri, ECM proteinleri ve / veya lipidler 1 arasındaki bağlanma aracılık etmektedir. Bağlanma hücreler fonksiyonel yapıları 1 oluşturmak, hem de tanır iletişim ve çevre 1-3 tepki verir. Çözünür proteinler (örneğin, sitokinler ve büyüme faktörleri), bir üç boyutlu (3D) için bağlanan hücre yüzeyi reseptörleri üzerine sıvı faz farklı olarak, hücre yapışma reseptörlerinin moleküler sınırlamak iki karşıt yüzey arasında köprü dar bir kavşak boşluk boyunca kendi ligandları ile bağlar oluşturabilir iki boyutlu (2D) arayüzü 4-7 difüzyon. Genel olarak, geleneksel bağlanma deneyleri (örneğin, yüzey plasmon rezonans ya da SPR) ile ölçülür 3D kinetiği aksine, bölme 11,12 akış, atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) 8-10 gibi özel teknikler ile ölçülebilir 2D kinetiği adres Mikropipet 13,14 optikcımbız 15 ve biyomembran kuvveti prob (BFP) 16-21.
Sadece hücresel uyum için fiziksel bağlantı sağlayarak daha fazla, yapışma molekülleri çevresi ile iletişim kurmak için hücre için sinyal makine önemli bir bileşenidir. Yapışma moleküllerinin ligand birleşmesi hücre içi sinyalizasyon ve nasıl ilk sinyal hücrenin içinde transdüse olduğunu başlatır nasıl anlayış giderek artan ilgi olmuştur. Sezgisel olarak, reseptör-ligand özellikleri bu indükler sinyalleri etkileyebilir bağlanması. Ancak, bunun nedeni, örneğin onların birçok sınırlamalar, yoksul bir zamansal çözünürlük ve uzaysal çözünürlüğü eksikliği tamamlamak biyokimyasal tahlillerin geleneksel topluluk kullanılarak hücre dışı etkileşim ve hücre içi sinyal olaylar arasındaki ilişkileri incelemek mekanik güçtür. Canlı hem biyofizik (kinetik bağlayıcı 2B reseptör ligand) izin yöntemleri ve biyokimyasal (sinyalizasyon) gözlem MevcutHücreler floresan özelliği 24-26 ile dahil ayarlanabilir sertlik 22 substratlar, 23 elastomer ayağı dizileri ve akış odası / mikroakışkan cihazları bulunmaktadır. Ancak, sinyalizasyon ve bağlayıcı reseptör-ligand Okunan zor sinyal olayları ile bağ özelliklerinin zamansal ve mekansal ilişkilerin incelemek için yapım (farklı yöntemler en sık) ayrı ayrı elde edilmelidir.
Konvansiyonel BFP yüksek uzaysal çözünürlüğü 17 ile ultrasensitif kuvvet spektroskopisi olduğunu. Tek moleküllü 2D kinetiği, mekanik özellikler ve yapısal değişikliklerin 14,16,19-21,27-29 ölçümünü sağlayan bir kuvvet sensörü gibi esnek bir kırmızı kan hücresi (RBC) kullanır. Bir flüoresan görüntüleme göre BFP (fBFP) tek bir molekül ölçeğinde bağlama tetiklenen hücre sinyal reseptör-ligandı bağlanma kinetiklerini ilişkilendirir. Yüzey mekanik işlemlerden bağlamında in situ hücre sinyal faaliyetlerinde Böyle bir düzenle,CAL uyarımı T-hücrelerinin 27 gözlendi. fBFP çok yönlüdür ve diğer hücrelere başka moleküller aracılık ettiği hücre yapışması ve sinyali çalışmaları için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Başarılı bir fBFP deneyi birkaç kritik hususlar gerektirir. Kuvvet hesaplama güvenilir olması için Birincisi, mikropipet, RBC ve prob boncuk mümkün olduğunca eş eksenli yakın olarak aynı hizada olmalıdır. RBC ve pipet arasındaki sürtünme ihmal edilebilir, böylece pipet içine RBC izdüşümü yaklaşık bir prob pipet çapı olması gerekir. Tipik bir insan RBC için en uygun pipet çapı Denklem 1 17,30 bir en uygun verimleri 2.0-2.4 mikron olduğunu. İkincisi, kuvvet kelepçe tahlil ve t…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research related to this paper and the development of the fBFP technology in the Zhu lab were supported by NIH grants AI044902, AI077343, AI038282, HL093723, HL091020, GM096187, and TW008753. We thank Evan Evans for inventing this empowering experimental tool, and members of the Evans lab, Andrew Leung, Koji Kinoshita, Wesley Wong, and Ken Halvorsen, for helping us to build the BFP. We also thank other Zhu lab members, Fang Kong, Chenghao Ge and Kaitao Li, for their helps in the instrumentation development.
Materials
| Table 1: Reagents/Equipment | |||
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4•H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Phosphate buffer preparation |
| Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Phosphate buffer preparation |
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | N2-5% buffer preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | N2-5% buffer preparation |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | N2-5% buffer preparation |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | N2-5% buffer preparation |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Bead functionalization |
| Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | RBC biotinylation |
| Nystatin | Sigma-Aldrich | N6261 | RBC osmolarity adjustment |
| Ammonium Hydroxide (NH4OH) | Sigma-Aldrich | A-6899 | Glass bead silanization |
| Methanol | BDH | 67-56-1 | Glass bead silanization |
| 30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | J. T. Barker | Jan-86 | Glass bead silanization |
| Acetic Acid (Glacial) | Sigma-Aldrich | ARK2183 | Glass bead silanization |
| 3-MERCAPTOPROPYLTRIMETHOXYSILANE(MPTMS) | Uct Specialties, llc | 4420-74-0 | Glass bead functionalization |
| Borosilicate Glass beads | Distrilab Particle Technology | 9002 | Glass bead functionalization |
| Streptavidin−Maleimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Glass bead functionalization |
| BSA | Sigma-Aldrich | A0336 | Ligand functionalizing |
| Fura2-AM | Life Technologies | F-1201 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Intracellular calcium fluorescence dye loading |
| Quantibrite PE Beads | BD Biosciences | 340495 | Density quantification |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | BD LSR II | Density quantification |
| Capillary Tube 0.7-1.0mm x 30" | Kimble Chase | 46485-1 | Micropipette making |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | sutter instrument | P-97 | Micropipette making |
| Pipette microforce | Narishige | MF-900 | Micropipette making |
| Mineral Oil | Fisher Scientific | BP2629-1 | Chamber assembly |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-G | Chamber assembly |
| Micro-injector | World Precision Instruments | MF34G-5 | Chamber assembly |
| 1ml Syringe | BD | 309602 | Chamber assembly |
| Micropipette holder | Narishige | HI-7 | Chamber assembly |
| Home-designed mechanical parts and adaptors fabrications using CNC machining. | Biophysics Instrument | All parts are customized according to the CAD designs. | BFP system |
| Microscope (TiE inverted) | Nikon | MEA53100 | BFP system |
| Objective CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72mm, Spg) | Nikon | MRH00401 | BFP system |
| Camera, GE680, 640×480, GigE, 1/3" CCD, mono | Graftek Imaging | 02-2020C | BFP system |
| Prosilica GC1290 – ICX445, 1/3", C-Mount, 1280×960, Mono., CCD, 12 Bit ADC | Graftek Imaging | 02-2185A | BFP system |
| Manual submicron probehead with high resolution remote control | Karl Suss | PH400 | BFP system |
| Anti-vibration table (5’ x 3’) | TMC | 77049089 | BFP system |
| 3D manual translational stage | Newport | 462-XYZ-M | |
| SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2012 SP5 | BFP system |
| LabVIEW software | National Instruments | Version 2009 | BFP system, BFP program |
| 3D piezo translational stage | Physik Instrumente | M-105.3P | BFP system |
| Linear piezo accuator | Physik Instrumente | P-753.1CD | BFP system |
| Micromanager software | Version 1.4 | fBFP system, fluorescence imaging program | |
| Dual Cam (DC-2) | Photometrics | 77054724 | fBFP system |
| Dual Cam emission filter (T565LPXR) | Photometrics | 77054725 | fBFP system |
| Fluorescence Camera | Hamamatsu | ORCA-R2 C10600-10B | fBFP system |
| Plastic paraffin film (Parafilm) | Bemis Company, Inc | PM996 | bottle sealing |
| Table 2: Buffer solutions | |||
| Carbonate/bicarbonate buffer (pH 8.5) | |||
| Sodium Carbonate (Na2CO3) | 8.4g/L | ||
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | 10.6g/L | ||
| Phosphate buffer (pH 6.5-6.8) | |||
| NaPhosphate monobasic NaH2PO4•H2O | 27.6g/L | ||
| Anhy. NaPhosphate dibasic Na2HPO4 | 28.4g/L | ||
| N2-5% buffer (pH 7.2) | |||
| Potassium chloride (KCl) | 20.77g/L | ||
| Sodium chloride (NaCl) | 2.38g/L | ||
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | 0.13g/L | ||
| Anhy. Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | 0.71g/L | ||
| Sucrose | 9.70g/L | ||
Riferimenti
- Aplin, A. E., Howe, A., Alahari, S. K., Juliano, R. L. Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins. Pharmacological reviews. 50, 197-263 (1998).
- Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
- Dado, D., Sagi, M., Levenberg, S., Zemel, A. Mechanical control of stem cell differentiation. Regenerative medicine. 7, 101-116 (2012).
- Edwards, L. J., Zarnitsyna, V. I., Hood, J. D., Evavold, B. D., Zhu, C. Insights into T cell recognition of antigen: significance of two-dimensional kinetic parameters. Frontiers in immunology. 3, 86 (2012).
- Zhu, C., Jiang, N., Huang, J., Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D. Insights from in situ analysis of TCR-pMHC recognition: response of an interaction network. Immunological reviews. 251, 49-64 (2013).
- Huang, J., Meyer, C., Zhu, C. T. T cell antigen recognition at the cell membrane. Molecular immunology. 52, 155-164 (2012).
- Zarnitsyna, V., Zhu, C. T. T cell triggering: insights from 2D kinetics analysis of molecular interactions. Physical biology. 9, 045005 (2012).
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).
- Marshall, B. T., et al. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423, 190-193 (2003).
- Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. The Journal of cell biology. 185, 1275-1284 (2009).
- Yago, T., et al. Catch bonds govern adhesion through L-selectin at threshold shear. The Journal of cell biology. 166, 913-923 (2004).
- Yago, T., et al. Platelet glycoprotein Ibalpha forms catch bonds with human WT vWF but not with type 2B von Willebrand disease vWF. The Journal of clinical investigation. 118, 3195-3207 (2008).
- Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette. Biophysical journal. 75, 1553-1572 (1998).
- Huang, J., et al. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464, 932-936 (2010).
- Heinrich, V., Wong, W. P., Halvorsen, K., Evans, E. Imaging biomolecular interactions by fast three-dimensional tracking of laser-confined carrier particles. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 24, 1194-1203 (2008).
- Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations. Biophysical journal. 94, 694-701 (2008).
- Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces. Biophysical. 68, 2580-2587 (1995).
- Evans, E., Leung, A., Heinrich, V., Zhu, C. Mechanical switching and coupling between two dissociation pathways in a P-selectin adhesion bond. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11281-11286 (2004).
- Ju, L., Dong, J. -. f., Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal Flanking Region of the A1 Domain Regulates the Force-dependent Binding of von Willebrand Factor to Platelet Glycoprotein Ib. Journal of Biological Chemistry. 288, (2013).
- Chen, W., Lou, J., Zhu, C. Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds. The Journal of biological chemistry. 285, 35967-35978 (2010).
- Chen, W., Lou, J., Evans, E. A., Zhu, C. Observing force-regulated conformational changes and ligand dissociation from a single integrin on cells. The Journal of cell biology. 199, 497-512 (2012).
- Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophysical journal. 102, L5-L7 (2012).
- Bashour, K. T., et al. CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2241-2246 (2014).
- Nesbitt, W. S., et al. Distinct glycoprotein Ib/V/IX and integrin alpha IIbbeta 3-dependent calcium signals cooperatively regulate platelet adhesion under flow. The Journal of biological chemistry. 277, 2965-2972 (2002).
- Mazzucato, M., Pradella, P., Cozzi, M. R., De Marco, L., Ruggeri, Z. M. Sequential cytoplasmic calcium signals in a 2-stage platelet activation process induced by the glycoprotein Ibalpha mechanoreceptor. Blood. 100, 2793-2800 (2002).
- Lefort, C. T., Ley, K. Neutrophil arrest by LFA-1 activation. Frontiers in immunology. 3, 157 (2012).
- Liu, B., Chen, W., Evavold, B. D., Zhu, C. Accumulation of dynamic catch bonds between TCR and agonist peptide-MHC triggers T cell signaling. Cell. 157, 357-368 (2014).
- Lou, J., et al. Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge. The Journal of cell biology. 174, 1107-1117 (2006).
- Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex. Nature communications. 5, 4886 (2014).
- Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods. Cellular and molecular bioengineering. 1, 276-288 (2008).
- Marshall, B. T., Sarangapani, K. K., Lou, J., McEver, R. P., Zhu, C. Force history dependence of receptor-ligand dissociation. Biophysical. 88, 1458-1466 (2005).
- Xiang, X., et al. Structural basis and kinetics of force-induced conformational changes of an alphaA domain-containing integrin. PloS one. 6, e27946 (2011).
