הזרקת גישת subretinal Limbal של ויראלי וקטורים לטיפול גנטי בעכברים הרשתית פיגמנט האפיתל
Summary
Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.
Abstract
The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.
Introduction
ברפואת עיניים, ריפוי גנטי התגלה כשיטת הטיפול בretinopathies ירש monogenic. יש retinopathies ירושה הקשורים לגנים באפיתל של רשתית פיגמנט (RPE) כולל amurosis לבר מולדת 1,2, פיגמנטוזה רטיניטיס 3, וchoroideremia 4. שדה המחקר של ריפוי גנטי מתרחב בשני מחקרים פרה-קליניים וניסויים קליניים באמצעות וקטורים ויראליים כגון וירוס adeno -associated (AAV), lentivirus (LV) ואדנווירוס (מודעות) 5. יש וקטורים ויראליים שונים כמיהות שונות ברשתית. לריפוי גנטי בטוח ויעיל, יש לבחור וקטורים ויראליים בזהירות בהתאם לתאי מטרה וגני המטרה.
תוואי מסירת הגן הוא גם חשובים למסירת גן יעילה למקד תאים, ובכך, אותו יש לבחור בקפידה, כמו גם. שתי שיטות הנפוצות ביותר למסירת התוך עינית של וקטורים ויראליים הם subretהזרקת INAL והזרקת זגוגית 6. ההזרקה האחרונה, הזגוגית, כבר בשימוש נרחב למסירת תרופה לטיפול בneovascularization choroidal בניוון רטוב הקשורות לגיל מקולרי (AMD) ובצקת מקולרית ברטינופתיה סוכרתית 7. מסלול זגוגית מספק חשיפה של וקטורים ויראליים לרשתית זגוגית והפנימית, אבל דיפוזיה של הווקטורים לרשתית חיצונית היא מוגבלת. מצד השני, מסלול subretinal מספק משלוח ישיר של וקטורים ויראליים למרחב הפוטנציאלי בין הרשתית ורשתית, גרימת בועה מקומית. לכן, הזרקת subretinal נחשבת כיום דרך יעילה יותר למיקוד תאי קולטי האור ורשתית. במונחים של גישה ניתוחית, pars Plana נבחר כאזור בטוח להזרקת זגוגית כדי למנוע נזק ברשתית בחולים אנושיים. פשוט על ידי שינוי בגישה זו כדי עכברים, אנחנו יכולים להזריק וקטורים ויראליים subretinally או intravireally באמצעות גישת limbal.
בסרטון הזהמאמר, אנחנו מדגימים שיטה קלה ונוחה של הזרקת subretinal של וקטורים ויראליים לרשתית עכברים. לאחר ניקור יחיד באחורי לימבוס עם מחט 30 G 1/2, מזרק microliter המצויד 33 מחט קהה G מוכנס לתוך חלל subretinal באמצעות האתר לנקב limbal. הווקטורים ויראליים של 1.5 – 2 μl נפח מוזרקים למרחב הפוטנציאלי בין הרשתית ורשתית גרימת שלפוחיות subretinal. הליך זה יכול להתבצע תחת הדמיה ישירה באמצעות מיקרוסקופ הניתוחי. תרגול חוזרים ונשנים יבטיח תוצאות לשכפול גם ללא הדמיה ישירה של היווצרות בועה. זה יעזור לי החוקרים לבצע ניסויים מדויקים וחיסכון בזמן למסירת גן subretinal ברשתית עכברים.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה וידאו, שתארנו את טכניקת הזרקת subretinal limbal-גישה בפירוט עם תוצאות נציג של הרשתית / דמית העין / שטוח הר scleral. זוהי טכניקה קלה ונוחה להזרקת subretinal של וקטורים ויראליים לרשתית. הדמיה ישירה של היווצרות בועה במהלך ההזרקה היא צעד חשוב למסירה מדויקת למתחילים. יש כמה טכניקות…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי סיאול האוניברסיטה הלאומית מענק המחקר (800-20140542), תכנית פיוניר המחקר של NRF / MEST (2012-0009544), וניתוח הטכנולוגיה התכנית ביו-האיתותים החדשנות של NRF / MEST (2009-0090895), וגרנט של NRF / MEST (2015M3A9E6028949).
Materials
| TWEEZERS DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06 mm TIPS | WPI | 500233 | |
| VANNAS Scissors S/S, 105mm | WPI | 555583S | |
| 33G Blunt needle | WPI | NF33BL-2 | |
| NanoFil Syringe, 10 microliter | WPI | NANOFIL | |
| RPE-KIT | WPI | RPE-KIT | For easy one hand injection |
| 30Gx1/2 (0.3mmx 13mm) BD PrecisionGlideTM Needle | BD | 305107 | Initial puncture for subretinal injection |
| Microscope Cover Glasses (No. 1 3 mm diameter) | Warner Instruments | 64-0720 (CS-3R) | |
| Leica operating microscope | Leica | LM M80 | |
| Fluoresecein microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Lentivirus | Thermo scientific | TMO.LV-Ctr | Used to dilute vectors |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to dilute vectors |
| Troperin (Phenylephrin 0.5%-Tropicamide 0.5%) | Hanmi | For dilation | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% (Sterile) | Bausch&Lomb | For topical anesthesia | |
| Healon GV OVD | Abbott Medical Optics Inc. | ||
| Zoletil 50 (tiletamine hypochloride and zolazepam hypochloride) | Virbac | For general anesthesia | |
| Rompun® injection (Xylazine HCl) | Bayer | For general anesthesia |
Riferimenti
- Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber’s congenital amaurosis. N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).
- Jacobson, S. G., et al. Gene therapy for leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years. Arch Ophthalmol. 130 (1), 9-24 (2012).
- Conlon, T. J., et al. Preclinical potency and safety studies of an AAV2-mediated gene therapy vector for the treatment of MERTK associated retinitis pigmentosa. Hum Gene Ther Clin Dev. 24 (1), 23-28 (2013).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial. Lancet. 383 (9923), 1129-1137 (2014).
- Trapani, I., Puppo, A., Auricchio, A. Vector platforms for gene therapy of inherited retinopathies. Prog Retin Eye Res. 43, 108-128 (2014).
- Liang, F. Q., Anand, V., Maguire, A. M., Bennett, J. Intraocular delivery of recombinant virus. Methods Mol Med. 47, 125-139 (2001).
- Peyman, G. A., Lad, E. M., Moshfeghi, D. M. Intravitreal injection of therapeutic agents. Retina. 29 (7), 875-912 (2009).
- Matsumoto, H., Miller, J. W., Vavvas, D. G. Retinal detachment model in rodents by subretinal injection of sodium hyaluronate. J Vis Exp. (79), (2013).
- Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J Vis Exp. (69), (2012).
- Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal transplantation of MACS purified photoreceptor precursor cells into the adult mouse retina. J Vis Exp. (84), e50932 (2014).
- Sahel, J. A., Roska, B. Gene therapy for blindness. Annu Rev Neurosci. 36, 467-488 (2013).
- Allocca, M., et al. Novel adeno-associated virus serotypes efficiently transduce murine photoreceptors. J Virol. 81 (20), 11372-11380 (2007).
- Takahashi, K., et al. Sustained transduction of ocular cells with a bovine immunodeficiency viral vector. Hum Gene Ther. 13 (11), 1305-1316 (2002).
- Rolling, F., et al. Gene therapeutic prospects in early onset of severe retinal dystrophy: restoration of vision in RPE65 Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium. Bull Mem Acad R Med Belg. 161 (10-12), 497-508 (2006).
- Le Meur, G., et al. Restoration of vision in RPE65-deficient Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium. Gene Ther. 14 (4), 292-303 (2007).
- Alexander, J. J., Hauswirth, W. W. Adeno-associated viral vectors and the retina. Adv Exp Med Biol. 613, 121-128 (2008).
- Puche, N., et al. Genetic and environmental factors associated with reticular pseudodrusen in age-related macular degeneration. Retina. 33 (5), 998-1004 (2013).
- Campochiaro, P. A. Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration. Hum Gene Ther. 22 (5), 523-529 (2011).
- Park, S. W., et al. Intracellular amyloid beta alters the tight junction of retinal pigment epithelium in 5XFAD mice. Neurobiol Aging. 35 (9), 2013-2020 (2014).
- Shin, B., et al. Intracellular cleavage of amyloid beta by a viral protease NIa prevents amyloid beta-mediated cytotoxicity. PLoS One. 9 (6), e98650 (2014).
