Лимбальных подход-субретинальной впрыска вирусных векторов для генной терапии у мышей пигментного эпителия сетчатки
Summary
Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.
Abstract
The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.
Introduction
В офтальмологии, генная терапия возникла как метода лечения в моногенных наследственных ретинопатии. Есть унаследованные ретинопатии, связанные с генами в пигментный эпителий сетчатки (ПЭС), включая Leber врожденной amurosis 1,2, пигментный ретинит 3 и 4 choroideremia. Полевые исследования генной терапии расширяется в обоих доклинических исследований и клинических испытаний с использованием вирусных векторов, таких как адено -associated вируса (AAV), лентивирус (LV) и аденовируса (Ad) 5. Различные вирусные векторы имеют разные тропизм в сетчатке. Для безопасной и эффективной генной терапии, вирусные векторы должны быть тщательно подобраны в соответствии с клетками-мишенями и генов-мишеней.
Маршрут доставки генов также важна для эффективного доставки генов в клетки-мишени, таким образом, она должна быть тщательно подобраны так. Два наиболее распространенных методов внутриглазного доставки вирусных векторов subretИнал впрыска и инъекция 6. Последнее, инъекция, широко используется для доставки наркотиков для лечения сосудистой оболочки глаза неоваскуляризации в мокрой возрастной макулярной дегенерации (AMD) и отека макулы в диабетической ретинопатии 7. Интравитреальная маршрут обеспечивает экспозицию вирусных векторов в стекловидного тела и внутренней сетчатки, но диффузия векторов внешней сетчатки ограничено. С другой стороны, субретинальная маршрут обеспечивает прямой доставки вирусных векторов для потенциального пространства между сетчатки и ПЭС, вызывая локализованное волдырь. Таким образом, субретинальной инъекции в настоящее время считается более эффективный маршрут для ориентации клетки фоторецепторов и РПЭ. С точки зрения хирургического подхода, пп Плана выбран в качестве безопасной зоне для инъекции в стекловидное тело, чтобы избежать повреждения сетчатки у больных людей. Просто изменяя этот подход к мышей, мы могли бы придать вирусных векторов subretinally или intravireally помощью лимбальных подхода.
В этом видеоСтатья, мы демонстрируем простое и удобный способ субретинальной инъекции вирусных векторов мышам ПЭС. После одного прокола в кзади от лимба с 30 г 1/2 иглы, 33 г тупой иглы оборудован мкл шприца вставлен в субретинальном пространства через лимбальных месте прокола. Вирусные векторы 1,5 – 2 мкл объем вводят в пространство между потенциальной сетчатки и РПЭ индукции субретинальной волдыри. Эта процедура может быть выполнена в соответствии с прямой визуализации с помощью операционного микроскопа. Повторное практика будет гарантировать воспроизводимые результаты даже без прямой визуализации образования пузырька. Это поможет исследователям для выполнения точных и экономии времени эксперименты по субретинальной доставки генов у мышей ПЭС.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом видео статье мы описали лимбальных-подход субретинальной технику впрыска подробно с представительными результатами НПП / сосудистой оболочки / склеры плоским горе. Это простой и удобный метод для субретинальной инъекции вирусных векторов в ПЭС. Прямая визуализация образования…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Сеульского национального университета научно-исследовательского гранта (800-20140542), Программа исследований Пионер NRF / МОНТ (2012-0009544), и анализ технологии Программа Био-сигнала Инновация NRF / МОНТ (2009-0090895), и Грант NRF / МОНТ (2015M3A9E6028949).
Materials
| TWEEZERS DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06 mm TIPS | WPI | 500233 | |
| VANNAS Scissors S/S, 105mm | WPI | 555583S | |
| 33G Blunt needle | WPI | NF33BL-2 | |
| NanoFil Syringe, 10 microliter | WPI | NANOFIL | |
| RPE-KIT | WPI | RPE-KIT | For easy one hand injection |
| 30Gx1/2 (0.3mmx 13mm) BD PrecisionGlideTM Needle | BD | 305107 | Initial puncture for subretinal injection |
| Microscope Cover Glasses (No. 1 3 mm diameter) | Warner Instruments | 64-0720 (CS-3R) | |
| Leica operating microscope | Leica | LM M80 | |
| Fluoresecein microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Lentivirus | Thermo scientific | TMO.LV-Ctr | Used to dilute vectors |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to dilute vectors |
| Troperin (Phenylephrin 0.5%-Tropicamide 0.5%) | Hanmi | For dilation | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% (Sterile) | Bausch&Lomb | For topical anesthesia | |
| Healon GV OVD | Abbott Medical Optics Inc. | ||
| Zoletil 50 (tiletamine hypochloride and zolazepam hypochloride) | Virbac | For general anesthesia | |
| Rompun® injection (Xylazine HCl) | Bayer | For general anesthesia |
Riferimenti
- Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber’s congenital amaurosis. N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).
- Jacobson, S. G., et al. Gene therapy for leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years. Arch Ophthalmol. 130 (1), 9-24 (2012).
- Conlon, T. J., et al. Preclinical potency and safety studies of an AAV2-mediated gene therapy vector for the treatment of MERTK associated retinitis pigmentosa. Hum Gene Ther Clin Dev. 24 (1), 23-28 (2013).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial. Lancet. 383 (9923), 1129-1137 (2014).
- Trapani, I., Puppo, A., Auricchio, A. Vector platforms for gene therapy of inherited retinopathies. Prog Retin Eye Res. 43, 108-128 (2014).
- Liang, F. Q., Anand, V., Maguire, A. M., Bennett, J. Intraocular delivery of recombinant virus. Methods Mol Med. 47, 125-139 (2001).
- Peyman, G. A., Lad, E. M., Moshfeghi, D. M. Intravitreal injection of therapeutic agents. Retina. 29 (7), 875-912 (2009).
- Matsumoto, H., Miller, J. W., Vavvas, D. G. Retinal detachment model in rodents by subretinal injection of sodium hyaluronate. J Vis Exp. (79), (2013).
- Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J Vis Exp. (69), (2012).
- Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal transplantation of MACS purified photoreceptor precursor cells into the adult mouse retina. J Vis Exp. (84), e50932 (2014).
- Sahel, J. A., Roska, B. Gene therapy for blindness. Annu Rev Neurosci. 36, 467-488 (2013).
- Allocca, M., et al. Novel adeno-associated virus serotypes efficiently transduce murine photoreceptors. J Virol. 81 (20), 11372-11380 (2007).
- Takahashi, K., et al. Sustained transduction of ocular cells with a bovine immunodeficiency viral vector. Hum Gene Ther. 13 (11), 1305-1316 (2002).
- Rolling, F., et al. Gene therapeutic prospects in early onset of severe retinal dystrophy: restoration of vision in RPE65 Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium. Bull Mem Acad R Med Belg. 161 (10-12), 497-508 (2006).
- Le Meur, G., et al. Restoration of vision in RPE65-deficient Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium. Gene Ther. 14 (4), 292-303 (2007).
- Alexander, J. J., Hauswirth, W. W. Adeno-associated viral vectors and the retina. Adv Exp Med Biol. 613, 121-128 (2008).
- Puche, N., et al. Genetic and environmental factors associated with reticular pseudodrusen in age-related macular degeneration. Retina. 33 (5), 998-1004 (2013).
- Campochiaro, P. A. Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration. Hum Gene Ther. 22 (5), 523-529 (2011).
- Park, S. W., et al. Intracellular amyloid beta alters the tight junction of retinal pigment epithelium in 5XFAD mice. Neurobiol Aging. 35 (9), 2013-2020 (2014).
- Shin, B., et al. Intracellular cleavage of amyloid beta by a viral protease NIa prevents amyloid beta-mediated cytotoxicity. PLoS One. 9 (6), e98650 (2014).
