الحوفي-النهج تحت الشبكية حقن الفيروسية المتجهات للعلاج الجيني في الفئران الشبكية الظهارة الصبغية
Summary
Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.
Abstract
The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.
Introduction
في طب العيون، برزت العلاج الجيني باعتباره طريقة العلاج في retinopathies الموروثة أحادية المنشأ. هناك retinopathies المرتبطة الموروثة الجينات في شبكية العين الظهارة الصبغية (RPE) بما في ذلك يبر amurosis الخلقية 1،2، التهاب الشبكية الصباغي 3، وتنكس المشيمية 4. مجال أبحاث العلاج الجيني تتوسع في كل من الدراسات قبل السريرية والتجارب السريرية باستخدام ناقلات فيروسية مثل فيروس الغدة -associated (AAV)، الفيروسة البطيئة (LV) واتش (الإعلان) 5. النواقل الفيروسية المختلفة لها مع الأجسام مختلفة في شبكية العين. لالعلاج الجيني آمنة وفعالة، ناقلات فيروسية ينبغي اختيار بعناية وفقا لالخلايا المستهدفة والجينات المستهدفة.
مسار توصيل الجينات مهم أيضا لتوصيل الجينات فعالة لاستهداف الخلايا، وبالتالي، فإنه ينبغي اختيار بعناية أيضا. وsubret الأساليب الأكثر شيوعا اثنين للتسليم العين من ناقلات فيروسيةحقن إينال وحقن intravitreal 6. هذا الأخير، حقن intravitreal، وقد استخدم على نطاق واسع لتسليم المخدرات لعلاج اتساع الأوعية الدموية المشيمية في الرطب الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD)، وذمة البقعة الصفراء في اعتلال الشبكية السكري 7. يوفر الطريق Intravitreal تعرض ناقلات فيروسية لشبكية العين الزجاجية والداخلية، ولكن انتشار ناقلات لشبكية العين الخارجي محدودة. من ناحية أخرى، والطريق تحت الشبكية يوفر النقل المباشر للناقلات فيروسية إلى الفضاء المحتمل بين شبكية العين وRPE، الأمر الذي أدى إلى فقاعة محلية. ولذلك، يعتبر الحقن تحت الشبكية حاليا طريقا أكثر كفاءة لاستهداف خلايا مستقبلة للضوء وRPE. من حيث النهج الجراحية، بارس يتم اختيار مسطح كمنطقة آمنة للحقن intravitreal لتجنب الضرر شبكية العين في المرضى من البشر. ببساطة عن طريق تعديل هذا النهج على الفئران، فإننا لا يمكن حقن ناقلات فيروسية subretinally أو intravireally عبر نهج الحوفي.
في هذا الفيديوالمادة، علينا أن نظهر وسيلة سهلة ومريحة للحقن تحت الشبكية من ناقلات فيروسية في الفئران RPE. بعد ثقب واحد في الخلفية لحوف مع 30 G 1/2 إبرة، يتم إدخال إبرة حادة G 33 ميكروليتر تجهيز الحقنة في الفضاء تحت الشبكية عبر موقع ثقب الحوفي. يتم حقن 2 حجم ميكرولتر إلى الفضاء المحتمل بين شبكية العين وRPE إحداث الفقاعات تحت الشبكية – ناقلات فيروسية 1.5. ويمكن تنفيذ هذا الإجراء في إطار رؤية مباشرة باستخدام الميكروسكوب الجراحي. والممارسة المتكررة يضمن النتائج القابلة للتكرار حتى من دون رؤية مباشرة لتشكيل فقاعة. وهذا سوف يساعد الباحثين على إجراء تجارب دقيقة وللوقت لتوصيل الجينات في الفئران تحت الشبكية RPE.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المقالة الفيديو، وصفنا تقنية الحقن تحت الشبكية النهج الحوفي في التفاصيل مع نتائج ممثلة من RPE / المشيمية / الصلبة شقة جبل. هذا هو أسلوب سهلة ومريحة للحقن تحت الشبكية من ناقلات فيروسية في RPE. التصور المباشر لتشكيل فقاعة خلال الحقن هو خطوة هامة لتسليم دقيقة للمبتدئ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذه الدراسة من قبل سيول القومي للبحوث منحة جامعة (800-20140542)، وبرنامج الرواد بحوث جبهة الخلاص الوطني / MEST (2012-0009544)، وبرنامج بيو الإشارة تحليل التكنولوجيا والابتكار من جبهة الخلاص الوطني / MEST (2009-0090895)، ومنح جبهة الخلاص الوطني / MEST (2015M3A9E6028949).
Materials
| TWEEZERS DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06 mm TIPS | WPI | 500233 | |
| VANNAS Scissors S/S, 105mm | WPI | 555583S | |
| 33G Blunt needle | WPI | NF33BL-2 | |
| NanoFil Syringe, 10 microliter | WPI | NANOFIL | |
| RPE-KIT | WPI | RPE-KIT | For easy one hand injection |
| 30Gx1/2 (0.3mmx 13mm) BD PrecisionGlideTM Needle | BD | 305107 | Initial puncture for subretinal injection |
| Microscope Cover Glasses (No. 1 3 mm diameter) | Warner Instruments | 64-0720 (CS-3R) | |
| Leica operating microscope | Leica | LM M80 | |
| Fluoresecein microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Lentivirus | Thermo scientific | TMO.LV-Ctr | Used to dilute vectors |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to dilute vectors |
| Troperin (Phenylephrin 0.5%-Tropicamide 0.5%) | Hanmi | For dilation | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% (Sterile) | Bausch&Lomb | For topical anesthesia | |
| Healon GV OVD | Abbott Medical Optics Inc. | ||
| Zoletil 50 (tiletamine hypochloride and zolazepam hypochloride) | Virbac | For general anesthesia | |
| Rompun® injection (Xylazine HCl) | Bayer | For general anesthesia |
Riferimenti
- Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber’s congenital amaurosis. N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).
- Jacobson, S. G., et al. Gene therapy for leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years. Arch Ophthalmol. 130 (1), 9-24 (2012).
- Conlon, T. J., et al. Preclinical potency and safety studies of an AAV2-mediated gene therapy vector for the treatment of MERTK associated retinitis pigmentosa. Hum Gene Ther Clin Dev. 24 (1), 23-28 (2013).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial. Lancet. 383 (9923), 1129-1137 (2014).
- Trapani, I., Puppo, A., Auricchio, A. Vector platforms for gene therapy of inherited retinopathies. Prog Retin Eye Res. 43, 108-128 (2014).
- Liang, F. Q., Anand, V., Maguire, A. M., Bennett, J. Intraocular delivery of recombinant virus. Methods Mol Med. 47, 125-139 (2001).
- Peyman, G. A., Lad, E. M., Moshfeghi, D. M. Intravitreal injection of therapeutic agents. Retina. 29 (7), 875-912 (2009).
- Matsumoto, H., Miller, J. W., Vavvas, D. G. Retinal detachment model in rodents by subretinal injection of sodium hyaluronate. J Vis Exp. (79), (2013).
- Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J Vis Exp. (69), (2012).
- Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal transplantation of MACS purified photoreceptor precursor cells into the adult mouse retina. J Vis Exp. (84), e50932 (2014).
- Sahel, J. A., Roska, B. Gene therapy for blindness. Annu Rev Neurosci. 36, 467-488 (2013).
- Allocca, M., et al. Novel adeno-associated virus serotypes efficiently transduce murine photoreceptors. J Virol. 81 (20), 11372-11380 (2007).
- Takahashi, K., et al. Sustained transduction of ocular cells with a bovine immunodeficiency viral vector. Hum Gene Ther. 13 (11), 1305-1316 (2002).
- Rolling, F., et al. Gene therapeutic prospects in early onset of severe retinal dystrophy: restoration of vision in RPE65 Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium. Bull Mem Acad R Med Belg. 161 (10-12), 497-508 (2006).
- Le Meur, G., et al. Restoration of vision in RPE65-deficient Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium. Gene Ther. 14 (4), 292-303 (2007).
- Alexander, J. J., Hauswirth, W. W. Adeno-associated viral vectors and the retina. Adv Exp Med Biol. 613, 121-128 (2008).
- Puche, N., et al. Genetic and environmental factors associated with reticular pseudodrusen in age-related macular degeneration. Retina. 33 (5), 998-1004 (2013).
- Campochiaro, P. A. Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration. Hum Gene Ther. 22 (5), 523-529 (2011).
- Park, S. W., et al. Intracellular amyloid beta alters the tight junction of retinal pigment epithelium in 5XFAD mice. Neurobiol Aging. 35 (9), 2013-2020 (2014).
- Shin, B., et al. Intracellular cleavage of amyloid beta by a viral protease NIa prevents amyloid beta-mediated cytotoxicity. PLoS One. 9 (6), e98650 (2014).
