चूहे रेटिना वर्णक उपकला में जीन थेरेपी के लिए वायरल वाहक के Limbal दृष्टिकोण subretinal इंजेक्शन
Summary
Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.
Abstract
The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.
Introduction
नेत्र विज्ञान में, जीन थेरेपी monogenic विरासत में मिला retinopathies में उपचार के साधन के रूप में उभरा है। लेबर जन्मजात amurosis 1,2, रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा 3, और अरंजितपटलता 4 सहित रेटिना वर्णक उपकला (RPE) में जीन के साथ जुड़े विरासत में मिला retinopathies कर रहे हैं। जीन थेरेपी के अनुसंधान के क्षेत्र पूर्व नैदानिक अध्ययन और ऐसे एडिनो -associated वायरस (एएवी), lentivirus (एल.वी.) और Adenovirus (एडी) के रूप में वायरल वैक्टर का उपयोग क्लिनिकल परीक्षण दोनों में विस्तार हो रहा है 5। विभिन्न वायरल वैक्टर रेटिना में अलग tropism है। एक सुरक्षित और प्रभावी जीन थेरेपी के लिए, वायरल वैक्टर ध्यान से लक्ष्य कोशिकाओं और लक्ष्य जीन के अनुसार चयन किया जाना चाहिए।
प्रभावी जीन डिलीवरी कोशिकाओं को लक्षित करने के लिए जीन वितरण का मार्ग इस प्रकार, यह सावधानी के रूप में अच्छी तरह से चुना जाना चाहिए, यह भी महत्वपूर्ण है। वायरल वाहक के अंतःचाक्षुष प्रसव के लिए दो सबसे आम तरीकों subret रहे हैंinal इंजेक्शन और intravitreal इंजेक्शन 6। उत्तरार्द्ध, intravitreal इंजेक्शन, व्यापक रूप से मधुमेह रेटिनोपैथी 7 में गीला उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन (एएमडी) और धब्बेदार शोफ में choroidal neovascularization के इलाज के लिए दवा वितरण के लिए इस्तेमाल किया गया है। Intravitreal मार्ग शीशे और भीतरी रेटिना को वायरल वाहक के जोखिम प्रदान करता है, लेकिन बाहरी रेटिना को वैक्टर के प्रसार सीमित है। दूसरी ओर, subretinal मार्ग एक स्थानीय छाला उत्प्रेरण, रेटिना और RPE के बीच संभावित अंतरिक्ष करने के लिए वायरल वैक्टर के प्रत्यक्ष प्रसव प्रदान करता है। इसलिए, subretinal इंजेक्शन वर्तमान में फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं और RPE को लक्षित करने के लिए एक अधिक कुशल मार्ग माना जाता है। शल्य दृष्टिकोण के संदर्भ में, प्लाना मानव रोगियों में रेटिना क्षति से बचने के लिए intravitreal इंजेक्शन के लिए एक सुरक्षित क्षेत्र के रूप में चुना गया है पार्स। बस चूहों के लिए इस दृष्टिकोण को संशोधित करके, हम limbal दृष्टिकोण के माध्यम से subretinally या intravireally वायरल वैक्टर इंजेक्षन सकता है।
इस वीडियो मेंलेख, हम चूहों RPE में वायरल वाहक के subretinal इंजेक्शन का एक आसान और सुविधाजनक तरीका प्रदर्शित करता है। एक 30 ग्राम 1/2 सुई के साथ किनारी के पीछे में एक पंचर करने के बाद, एक 33 जी कुंद सुई सुसज्जित माइक्रोलीटर सिरिंज limbal पंचर साइट के माध्यम से subretinal अंतरिक्ष में डाला जाता है। 1.5 के वायरल वैक्टर – 2 μl मात्रा रेटिना और RPE subretinal blebs उत्प्रेरण के बीच संभावित अंतरिक्ष के लिए इंजेक्ट कर रहे हैं। यह प्रक्रिया शल्य माइक्रोस्कोप का उपयोग प्रत्यक्ष दृश्य के तहत किया जा सकता है। बार-बार अभ्यास भी छाला गठन के प्रत्यक्ष दृश्य के बिना replicable के परिणाम की गारंटी होगी। इस चूहों RPE में subretinal जीन डिलीवरी के लिए सटीक और timesaving प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए शोधकर्ताओं में मदद मिलेगी।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस वीडियो लेख में, हम RPE / रंजित / स्क्लेरल फ्लैट पर्वत के प्रतिनिधि परिणामों के साथ विस्तार से limbal-दृष्टिकोण subretinal इंजेक्शन तकनीक का वर्णन किया। इस RPE में वायरल वाहक के subretinal इंजेक्शन के लिए एक आसान और सुविधाज…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन सियोल नेशनल यूनिवर्सिटी रिसर्च ग्रांट (800-20140542) द्वारा समर्थित किया गया था, एनआरएफ / MEST पायनियर रिसर्च प्रोग्राम (2012-0009544), और एनआरएफ / MEST की जैव सिग्नल विश्लेषण प्रौद्योगिकी अभिनव कार्यक्रम (2009-0090895), और एनआरएफ / MEST का अनुदान (2015M3A9E6028949)।
Materials
| TWEEZERS DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06 mm TIPS | WPI | 500233 | |
| VANNAS Scissors S/S, 105mm | WPI | 555583S | |
| 33G Blunt needle | WPI | NF33BL-2 | |
| NanoFil Syringe, 10 microliter | WPI | NANOFIL | |
| RPE-KIT | WPI | RPE-KIT | For easy one hand injection |
| 30Gx1/2 (0.3mmx 13mm) BD PrecisionGlideTM Needle | BD | 305107 | Initial puncture for subretinal injection |
| Microscope Cover Glasses (No. 1 3 mm diameter) | Warner Instruments | 64-0720 (CS-3R) | |
| Leica operating microscope | Leica | LM M80 | |
| Fluoresecein microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Lentivirus | Thermo scientific | TMO.LV-Ctr | Used to dilute vectors |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to dilute vectors |
| Troperin (Phenylephrin 0.5%-Tropicamide 0.5%) | Hanmi | For dilation | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% (Sterile) | Bausch&Lomb | For topical anesthesia | |
| Healon GV OVD | Abbott Medical Optics Inc. | ||
| Zoletil 50 (tiletamine hypochloride and zolazepam hypochloride) | Virbac | For general anesthesia | |
| Rompun® injection (Xylazine HCl) | Bayer | For general anesthesia |
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