Limbal Approach-subretinal Injektion av virala vektorer för genterapi hos möss retinal pigmentepitel
Summary
Subretinal injection is a surgical technique for effective gene delivery to retinal pigment epithelium in the mouse eye. Here we describe an easy and replicable method for subretinal injection of viral vectors to retinal pigment epithelium in experimental mice.
Abstract
The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in retinopathies using non-viral and viral gene delivery to the retina and retinal pigment epithelium (RPE). Subretinal injection is the best approach to deliver viral vectors directly to RPE cells. Before the clinical trial of a gene therapy, it is inevitable to validate the efficacy of the therapy in animal models of various retinopathies. Thus, subretinal injection in mice becomes a fundamental technique for an ocular gene therapy. In this protocol, we provide the easy and replicable technique for subretinal injection of viral vectors to experimental mice. This technique is modified from the intravitreal injection, which is widely used technique in ophthalmology clinics. The representative results of RPE/choroid/scleral complex flat-mount will help to understand the efficacy of this technique and adjust the volume and titer of viral vectors for the extent of gene transduction.
Introduction
I oftalmologi, har genterapi blivit den behandlingsform i monogena ärvda retinopatier. Det finns ärvda retinopatier associerade med gener i näthinnans pigmentepitel (RPE) inklusive Leber medfödd amurosis 1,2, retinitis pigmentosa 3 och choroideremia 4. Forskningsområdet för genterapi expanderar i både prekliniska studier och kliniska prövningar med virala vektorer såsom adeno -associated virus (AAV), lentivirus (LV) och adenovirus (Ad) 5. Olika virala vektorer har olika tropism i näthinnan. För en säker och effektiv genterapi, bör virala vektorer noga utvalda enligt målceller och målgener.
Rutten för gentillförsel är också viktigt för effektiv genleverans till målceller, vilket således bör det väljas omsorgsfullt samt. De två vanligaste metoderna för intraokulär leverans av virala vektorer subretInal injektion och intravitreal injektion 6. Den senare, intravitreal injektion, har använts i stor utsträckning för drug delivery för behandling av koroidal kärlnybildning i vått åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) och makulaödem i diabetesretinopati 7. Intravitreal väg ger exponering av virala vektorer till glaskroppen och inre näthinnan, men spridningen av vektorerna till yttre näthinnan är begränsad. Å andra sidan, subretinal väg ger direkt leverans av virala vektorer för att det potentiella utrymmet mellan näthinnan och RPE, inducera en lokaliserad Bleb. Därför är subretinal injektion för närvarande vara mer effektiv väg för att rikta fotoreceptorceller och RPE. När det gäller kirurgisk metod, pars plana väljs som ett säkert område för intravitreal injektion för att undvika skada på näthinnan hos människor. Genom att helt enkelt ändra denna inställning till möss, kan vi injicera virala vektorer subretinally eller intravireally via limbus tillvägagångssätt.
I den här videonartikeln visar vi en enkel och bekväm metod för subretinal injektion av virala vektorer i möss RPE. Efter enda punktering på bakre till limbus med en 30 G 1/2 nål, är en 33 G trubbig nål utrustad mikroliter spruta in i subretinalområdet via limbal punktionsställe. De virala vektorer på 1,5 – 2 pl volym injiceras till den potentiella utrymmet mellan näthinnan och RPE inducera subretinal blåsor. Detta förfarande kan utföras under direkt visualisering med hjälp av operationsmikroskop. Upprepad praktiken kommer att garantera repliker resultat även utan direkt visualisering av bubblan bildning. Detta kommer att hjälpa forskarna att utföra exakta och tidsbesparande experiment för subretinal genleverans hos möss RPE.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna video artikeln beskrev vi limbal-strategi subretinal injektionsteknik i detalj med representativa resultat av RPE / koroidea / skleral platt-mount. Detta är ett enkelt och bekvämt teknik för subretinal injektion av virala vektorer i RPE. Direkt visualisering av Bleb bildning under injektionen är ett viktigt steg för korrekt leverans för nybörjare. Det finns några subretinala injektionsteknik som införts i Journal of Visualized Experiments 8-10. Subretinalområdet är det potentiella utrymmet …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av Seoul National University Research Grant (800-20140542), Pioneer forskningsprogrammet NRF / MEST (2012-0009544) och Bio-Signal Analysis Technology Innovation Program för NRF / MEST (2009-0090895), och meddelande av NRF / MEST (2015M3A9E6028949).
Materials
| TWEEZERS DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06 mm TIPS | WPI | 500233 | |
| VANNAS Scissors S/S, 105mm | WPI | 555583S | |
| 33G Blunt needle | WPI | NF33BL-2 | |
| NanoFil Syringe, 10 microliter | WPI | NANOFIL | |
| RPE-KIT | WPI | RPE-KIT | For easy one hand injection |
| 30Gx1/2 (0.3mmx 13mm) BD PrecisionGlideTM Needle | BD | 305107 | Initial puncture for subretinal injection |
| Microscope Cover Glasses (No. 1 3 mm diameter) | Warner Instruments | 64-0720 (CS-3R) | |
| Leica operating microscope | Leica | LM M80 | |
| Fluoresecein microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Lentivirus | Thermo scientific | TMO.LV-Ctr | Used to dilute vectors |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Used to dilute vectors |
| Troperin (Phenylephrin 0.5%-Tropicamide 0.5%) | Hanmi | For dilation | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution USP, 0.5% (Sterile) | Bausch&Lomb | For topical anesthesia | |
| Healon GV OVD | Abbott Medical Optics Inc. | ||
| Zoletil 50 (tiletamine hypochloride and zolazepam hypochloride) | Virbac | For general anesthesia | |
| Rompun® injection (Xylazine HCl) | Bayer | For general anesthesia |
Riferimenti
- Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber’s congenital amaurosis. N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).
- Jacobson, S. G., et al. Gene therapy for leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years. Arch Ophthalmol. 130 (1), 9-24 (2012).
- Conlon, T. J., et al. Preclinical potency and safety studies of an AAV2-mediated gene therapy vector for the treatment of MERTK associated retinitis pigmentosa. Hum Gene Ther Clin Dev. 24 (1), 23-28 (2013).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial. Lancet. 383 (9923), 1129-1137 (2014).
- Trapani, I., Puppo, A., Auricchio, A. Vector platforms for gene therapy of inherited retinopathies. Prog Retin Eye Res. 43, 108-128 (2014).
- Liang, F. Q., Anand, V., Maguire, A. M., Bennett, J. Intraocular delivery of recombinant virus. Methods Mol Med. 47, 125-139 (2001).
- Peyman, G. A., Lad, E. M., Moshfeghi, D. M. Intravitreal injection of therapeutic agents. Retina. 29 (7), 875-912 (2009).
- Matsumoto, H., Miller, J. W., Vavvas, D. G. Retinal detachment model in rodents by subretinal injection of sodium hyaluronate. J Vis Exp. (79), (2013).
- Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J Vis Exp. (69), (2012).
- Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal transplantation of MACS purified photoreceptor precursor cells into the adult mouse retina. J Vis Exp. (84), e50932 (2014).
- Sahel, J. A., Roska, B. Gene therapy for blindness. Annu Rev Neurosci. 36, 467-488 (2013).
- Allocca, M., et al. Novel adeno-associated virus serotypes efficiently transduce murine photoreceptors. J Virol. 81 (20), 11372-11380 (2007).
- Takahashi, K., et al. Sustained transduction of ocular cells with a bovine immunodeficiency viral vector. Hum Gene Ther. 13 (11), 1305-1316 (2002).
- Rolling, F., et al. Gene therapeutic prospects in early onset of severe retinal dystrophy: restoration of vision in RPE65 Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium. Bull Mem Acad R Med Belg. 161 (10-12), 497-508 (2006).
- Le Meur, G., et al. Restoration of vision in RPE65-deficient Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium. Gene Ther. 14 (4), 292-303 (2007).
- Alexander, J. J., Hauswirth, W. W. Adeno-associated viral vectors and the retina. Adv Exp Med Biol. 613, 121-128 (2008).
- Puche, N., et al. Genetic and environmental factors associated with reticular pseudodrusen in age-related macular degeneration. Retina. 33 (5), 998-1004 (2013).
- Campochiaro, P. A. Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration. Hum Gene Ther. 22 (5), 523-529 (2011).
- Park, S. W., et al. Intracellular amyloid beta alters the tight junction of retinal pigment epithelium in 5XFAD mice. Neurobiol Aging. 35 (9), 2013-2020 (2014).
- Shin, B., et al. Intracellular cleavage of amyloid beta by a viral protease NIa prevents amyloid beta-mediated cytotoxicity. PLoS One. 9 (6), e98650 (2014).
