산화 티타늄을 사용하여 수성 환경에서 단백질과 세포를 포토 패터닝<sub> 2</sub> 광촉매
Summary
We describe a protocol for modifying cell affinity of a scaffold surface in aqueous environment. The method takes advantage of titanium dioxide photocatalysis to decompose organic film in the photo-irradiated region. We show that it can be used to create microdomains of scaffolding proteins, both ex situ and in situ.
Abstract
이산화 티타늄의 표면 (이산화 티탄)에 흡착 된 유기 오염 물질은 자외선 (UV) 광 하에서 광촉매 작용에 의해 분해 될 수있다. 여기에서 우리는 로컬 기판 표면의 세포 친 화성을 변경할 수있는 이산화 티탄 광촉매를 사용하는 새로운 프로토콜을 설명합니다. 이 실험을 위해, 얇은 이산화 티탄 막은 스퍼터 – 코팅 유리 커버 슬립이며, 이산화 티탄 표면은 후속 적으로 세포 부착을 억제 옥타 데실 트리클로로 실란 (OTS)로부터 유도 된 단일 층 오가 노 실란으로 개질 하였다. 샘플은 세포 배양 배지에 침지하고, UV 광이 각형 영역에 집중 조사 하였다. 신경 세포주 PC12 세포 샘플에서 도금 될 때, 셀은 UV 조사 된 영역에 부착. 우리는 상기 셀이 상기 기판 상에 성장하는 경우에도,이 표면 개질도 즉, 인 시츄로 수행 될 수 있음을 보여준다. 표면의 적절한 수정은 세포 외 기질 P 필요콜라겐 rotein하면 UV 조사시의 중간에 존재한다. 여기에 제시된 기술은 잠재적 하에서 배양 세포를 공 배양 시스템을 구축하거나 임의로 조작 패터닝 여러 세포 유형에 이용 될 수있다.
Introduction
반도체 리소그래피 공정 및 그 유도체 – 포토 리소그래피 1,2, 전자빔 리소그래피 3-6 및 7-10 인쇄 마이크로 콘택트로서 – 이제 정의 된 위치 및 형상에 살아있는 세포가 성장하는 세포 생물학에서 확립 도구가되었다. 패터닝 방법은, 비 허용 세포에서 배경 허용 코팅 마이크로 섬 이루어진 미세 가공 된 기판의 사용에 의존한다. 이러한 기판 패턴 세포에 템플릿 역할을합니다. 이러한 기술은 우리에게 세포의 고유 특성을 추출하고, 세포 기반 약물 검사 (11)의 처리량을 증가시키기 위해, 단일 및 다중 세포 수준에서 세포와 그 기능을 설계 할 수있는 새로운 방법을 제공하고 있습니다.
템플릿 패턴 형상이 즉, 현장에서 변경 될 수 있다면 세포의 배양 동안 자유도 셀 패턴에서 크게 증가 할 것urface. 그들은 분위기 또는 진공에서 샘플을 처리 이후 패턴 형성 방법은 종래의 직접 여기에 적용 할 수 없다. 따라서 여러 새로운 표면 개질 기술들은 단지 몇 가지 이름을, 광 반응성 화합물 (12, 13) 또는 레이저 어블 5,14에, 예를 들면, 기준이되는, 제안되어있다. 제안 된 방법은 잘 최 등. (16)와 나카니시 (17)에 의해 최근에. Robertus 등의 알 15을 검토하고있다.
다음은이 문서에서, 우리는 이산화 티타늄에 유기 분자의 광촉매 분해의 활용에 현장 표면 개질 (이산화 티탄) 표면 (18, 19)의 새로운 프로토콜을 설명합니다. 이 방법에서, 이산화 티탄 막은 유리 기판과 세포 인터페이스 유기 막 사이에 삽입되고, 상기 유기 막 국소 자외선 (UV)을 조사하여 그 자리에서 분해되어관심 영역 (λ <388 ㎚)에 빛. 우리는 새로운 프로토콜은 세포 외 기질 단백질과 살아있는 세포 모두 외부 계와 시츄 미세 패턴을 생성하는데 사용될 수 있음을 보여준다. 이산화 티탄은 세포 배양 실험에서 소개가 친절하게 기능이있는, 생체 적합성 화학적으로 안정하고, 광학적으로 투명하다. 이 프로토콜은 세포 배양 환경에서 세포 배양 지지체를 수정하기위한 재료 과학 기반의 대안을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현재의 프로토콜에서, 이산화 티탄 막을 RF 마그네트론 스퍼터링에 의해 형성 하였다. 그것은 우리가 재현 서브 나노 거칠기 광촉매 이산화 티탄 필름을 제조 할 수 있기 때문에 우리는 증착이 방법을 선호. 스퍼터 증착 공정은 재료 과학자 및 전자 엔지니어 잘 알고 있지만, 생물 학자에 매우 액세스 할 수 없습니다. 이 경우에, 스핀 코팅 이산화 티탄 필름 (23)의 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors thank Mr. Kotaro Okubo for the kind assistance with SEM imaging. This work was supported by the Japan Society for the Promotion of Science Grant-in-Aid for Basic Research (B) (20310069), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (25880021), and by research grants from the Kurata Memorial Hitachi Science and Technology Foundation and the Nippon Sheet Glass Foundation for Materials Science and Engineering.
Materials
| Glass coverslip | Warner Instruments | CS-15R15 | 15 mm, #1.5 thickness |
| Diamond scriber | Ogura Jewel Industry | D-Point Pen | |
| RF sputtering system | ANELVA | SPC350 | |
| TiO2 sputtering target | Kojundo Chemical Lab | Titanium (IV) oxide, target | Purity, 99.9% |
| Plasma reactor | Yamato | PR301 | |
| n-octadecyltrichlorosilane (OTS) |
Aldrich | 104817 | |
| Toluene | Wako | 204-01866 | |
| Tissue-culture dish (35 mm) | Greiner | 627160 | |
| Tissue-culture dish (60 mm) | BD Falcon | 353002 | |
| Type-IV collagen | Nitta Gelatin | Cellmatrix Type IV | |
| D-PBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | Heat-inactivate and pass through a 0.22 mm filter before use |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | Pass through a 0.22 mm filter before use |
| Penicillin-streptomycin (100x) | Nacalai tesque | 26253-84 | |
| 7S nerve growth factor (NGF) | Alomone Labs | N-130 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Dojindo | N001 | Stock solution in 0.5 M |
| TiO2 nanoparticle | Tayca | TKD-701 |
Riferimenti
- Hughes, M. A., Brennan, P. M., Bunting, A. S., Shipston, M. J., Murray, A. F. Cell Patterning on Photolithographically Defined Parylene-C: SiO2 Substrates. J. Vis. Exp. (85), e50929 (2014).
- Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled Outgrowth of Dissociated Neurons on Patterned Substrates. J. Neurosci. 8, 4098-4120 (1988).
- Pensen, D., Heinz, W. F., Werbin, J. L., Hoh, J. H., Haviland, D. B. Electron Beam Patterning of Fibronectin Nanodots that Support Focal Adhesion Formation. Soft Matter. 3, 1280-1284 (2007).
- Tanii, T., et al. Application of Organosilane Monolayer Template to Quantitative Evaluation of Cancer Cell Adhesive Ability. Jpn. J. Appl. Phys. 50, 06GL01 (2011).
- Yamamoto, H., et al. In-Situ Guidance of Individual Neuronal Processes by Wet Femtosecond Laser Processing of Self-Assembled Monolayers. Appl. Phys. Lett. 99, 163701-1610 (2011).
- Yamamoto, H., et al. Differential Neurite Outgrowth is Required for Axon Specification by Cultured Hippocampal Neurons. J. Neurochem. 123, 904-910 (2012).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).
- Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement. J. Vis. Exp. (55), e3164 (2011).
- Singhvi, R., et al. Engineering Cell Shape and Function. Science. 264, 696-698 (1126).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276, 1425-1428 (1997).
- Degot, S., et al. Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects using Micropatterned Cells. J. Vis. Exp. (46), e2514 (2010).
- Nakanishi, J., et al. Photoactivation of a Substrate for Cell Adhesion under Standard Fluorescence Microscopes. J. Am. Chem. Soc. 126, 16314-16315 (2004).
- Kim, M., et al. Addressable Micropatterning of Multiple Proteins and Cells by Microscope Projection Photolithography Based on a Protein Friendly Photoresist. Langmuir. 26, 12112-12118 (2010).
- Deka, G., Okano, K., Kao, F. -. J. Dynamic Photopatterning of Cells In Situ by Q-Switched Neodymium-Doped Yttrium Ortho-Vanadate. Laser. J. Biomed. Opt. 19, 011012 (2014).
- Robertus, J., Browne, W. R., Feringa, B. L. Dynamic Control over Cell Adhesive Properties using Molecular-Based Surface Engineering Strategies. Chem. Soc. Rev. 39, 354-378 (2010).
- Choi, I., Yeo, W. -. S. Self-Assembled Monolayers with Dynamicity Stemming from (Bio)chemical Conversions: From Construction to Application. ChemPhysChem. 14, 55-69 (2013).
- Nakanishi, J. Switchable Substrates for Analyzing and Engineering Cellular Functions. Chem. Asian J. 9, 406-417 (2014).
- Yamamoto, H., et al. In Situ Modification of Cell-Culture Scaffolds by Photocatalytic Decomposition of Organosilane Monolayers. Biofabrication. 6, 035021 (2014).
- Sekine, K., Yamamoto, H., Kono, S., Ikeda, T., Kuroda, A., Tanii, T. Surface Modification of Cell Scaffold in Aqueous Solution using TiO2 Photocatalysis and Linker Protein L2 for Patterning Primary Neurons. e-J. Surf. Sci. Nanotech. 13, 213-218 (2015).
- Arima, Y., Iwata, H. Effects of Surface Functional Groups on Protein Adsorption and Subsequent Cell Adhesion using Self-Assembled Monolayers. J. Mater. Chem. 17, 4079-4087 (2007).
- Fujishima, A., Zhang, X., Tryk, D. A. TiO2 Photocatalysis and Related Surface Phenomena. Surf. Sci. Rep. 63, 515-582 (2008).
- Sigal, G. B., Mrksich, M., Whitesides, G. M. Effect of Surface Wettability on the Adsorption of Proteins and Detergents. J. Am. Chem. Soc. 120, 3464-3473 (1998).
- Zhang, X., et al. A Transparent and Photo-Patternable Superhydrophobic Film. Chem. Commun. 2007, 4949-4951 (1039).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing Hippocampal Neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
