Descriviamo un protocollo per modificare l'affinità cellulare di una superficie di scaffold in ambiente acquoso. Il metodo sfrutta la fotocatalisi del biossido di titanio per decomporre il film organico nella regione foto-irradiata. Mostriamo che può essere utilizzato per creare microdomini di proteine di impalcatura, sia ex situ che in situ.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Photopatterning proteine e cellule in acquosa ambiente utilizzando TiO
In questo articolo
Sommario
Abstract
Contaminanti organici adsorbiti sulla superficie del biossido di titanio (TiO 2) possono essere decomposti da fotocatalisi sotto ultravioletta (UV). Qui si descrive l'impiego di TiO 2 fotocatalisi alterare localmente affinità cellule della superficie del substrato un nuovo protocollo. Per questo esperimento, un sottile TiO 2 film era sputtering rivestite su un vetrino di vetro, e la superficie TiO 2 è stato successivamente modificato con un monostrato silano organico derivato da octadecyltrichlorosilane (OTS), che inibisce l'adesione cellulare. Il campione è stato immerso in un mezzo di coltura cellulare, e concentrato luce UV è stata irradiata ad una regione ottagonale. Quando un neuronali PC12 linea cellulare sono state piastrate sul campione, cellule rispettati solo sulla zona UV-irradiati. Mostriamo inoltre che tale modificazione superficiale può essere eseguita anche in situ, cioè, anche quando le cellule crescono sul substrato. Modifica corretta della superficie necessaria una matrice extracellulare protein collagene di essere presente nel mezzo al momento della irradiazione UV. La tecnica qui presentata può potenzialmente essere impiegato in tipi di cellule patterning più per la costruzione di sistemi di co-coltura o di manipolare arbitrariamente cellule in coltura.
Introduzione
Processi litografia di semiconduttori e suoi derivati - come fotolitografia 1,2, litografia a fascio elettronico 3-6, 7-10 e stampare microcontact - sono diventati uno strumento stabilito in biologia cellulare crescere cellule viventi in una posizione e geometria definita. Il metodo patterning si basa sull'utilizzo di substrati microfabbricati, costituito da micro-isola di cellule permissive rivestimento in uno sfondo non permissive. Tale substrato serve come modello per modello cellule. Queste tecnologie ci hanno fornito i nuovi metodi per progettare cellule e la loro funzione a livello singolo e multi-cellulari, per estrarre le proprietà....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Preparazione di TiO2 Rivestiti vetro Coverslip
- Numero i coprioggetti usando una punta per tracciare diamante. Questo non solo aiuta a tenere traccia di ogni coprioggetto ma anche per garantire che il lato corretto del campione è rivolta verso l'alto. Pulire i coprioggetti, prima sotto un getto DDH 2 O, poi immergendole in una soluzione piranha (H 2 SO 4: H 2 O 2 = 4: 1). Dopo 10 minuti, risciacquare accuratamente i coprioggetti, 8 volte in DDH 2 O. Asciugare il coprioggetto sotto N 2 flusso.
- Impostare TiO 2 destinazione nel sistema sputtering a radiofre....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Figura 2A mostra un'immagine in sezione microscopia elettronica a scansione (SEM) della TiO 2 film di sputtering depositato. Dall'osservazione, spessore del film è stata stimata essere di circa 150 nm. Notevole ecco la planarità del depositato TiO 2 film. Ulteriori analisi mediante microscopia a forza atomica (AFM) ha rivelato che la radice quadrata media (RMS) rugosità della superficie era di 0,2 nm (Figura 2B).
Quando la super.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Nel nostro attuale protocollo, TiO 2 film è stato formato da RF-magnetron sputtering. Favoriamo questo metodo di deposito in quanto ci permette di preparare in modo riproducibile un fotocatalitico TiO 2 film con una rugosità sub-nm. Anche se i processi di deposizione sputtering sono familiari a scienziati dei materiali e ingegneri elettronici, potrebbe non essere abbastanza accessibile per i biologi. In tal caso, TiO 2 film di spin-rivestite sarebbe una scelta alternativa 23. .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il Sig. Kotaro Okubo per la gentile assistenza con l'imaging SEM. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Japan Society for the Promotion of Science Grant-in-Aid for Basic Research (B) (20310069), dal Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (25880021) e da sovvenzioni per la ricerca della Kurata Memorial Hitachi Science and Technology Foundation e della Nippon Sheet Glass Foundation for Materials Science and Engineering.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Vetrino coprioggetti | Warner Instruments | CS-15R15 | 15 mm, spessore #1,5 |
| Graffiatore diamantato | Ogura Jewel Industry | D-Point Pen | |
| Sistema di sputtering RF | ANELVA | SPC350 | |
| TiO2 sputtering target | Kojundo Chemical Lab | Ossido di titanio (IV), purezza target | 99,9% |
| Yamato | PR301 | ||
| n-ottadeciltriclorosilano (OTS) | Aldrich | 104817 | |
| Toluene | Wako | 204-01866 | |
| Piatto per coltura tissutale (35 mm) | Greiner | 627160 | |
| Piatto per coltura tissutale (60 mm) | BD Falcon | 353002 | |
| Collagene di tipo IV | Nitta Gelatina | Cellmatrix Tipo IV | |
| D-PBS | Gibco | 14190-144 | |
| Mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| Siero fetale bovino | Gibco | 12483-020 | Inattivare a caldo e passare attraverso un 0,22 μ m filtrare prima dell'uso |
| Siero di cavallo | Gibco | 26050-088 | Passare attraverso un 0,22 μ m filtro prima dell'uso |
| Penicillina-streptomicina (100x) | Nacalai tesque | 26253-84 | |
| 7S nerve growth factor (NGF) | Alomone Labs | N-130 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Dojindo | N001 | Soluzione madre in nanoparticella 0,5 M |
| TiO2 | Tayca | TKD-701 |
Riferimenti
- Hughes, M. A., Brennan, P. M., Bunting, A. S., Shipston, M. J., Murray, A. F. Cell Patterning on Photolithographically Defined Parylene-C: SiO2 Substrates. J. Vis. Exp. (85), e50929(2014).
- Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled Outgrowth of Dissociated Neurons on Patter....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
