TiO kullanarak sulu bir ortamda Proteinler ve Hücreler photopatterning<sub> 2</sub> Photocatalysis
Summary
We describe a protocol for modifying cell affinity of a scaffold surface in aqueous environment. The method takes advantage of titanium dioxide photocatalysis to decompose organic film in the photo-irradiated region. We show that it can be used to create microdomains of scaffolding proteins, both ex situ and in situ.
Abstract
Titanyum dioksit yüzeyi (TiO2) üzerinde adsorbe organik kirletici ultraviyole (UV) ışık altında fotokatalizle çürümüş olabilir. Burada yerel alt tabaka yüzeyinin hücre yakınlık değiştirmek için TiO2 fotokatalizden kullanan yeni bir protokol açıklar. Bu deney için, ince bir TiO2 Film püskürtme ile kaplanmış bir cam lamel, ve TiO2 yüzey, daha sonra hücre yapışmasını inhibe eden oktadesiltriklorosilandır (OTS) türetilen bir organosilan tek tabaka ile modifiye edildi. Örnek bir hücre kültürü ortamı içine daldırılır ve UV ışığı sekizgen bölgeye ışınlandı odaklanmıştır. Bir nöronal hücre çizgisi PC12 hücreleri numune üzerine kaplandı, hücreler sadece UV-radyasyona alana bağlı kalmıştır. Biz daha hücre alt-tabaka üzerinde büyüyen bile bu yüzey modifikasyonu, aynı zamanda örneğin, in situ gerçekleştirilebilir göstermektedir. Yüzeyin düzgün modifikasyonu bir hücre dışı matris p gereklikollajen rotein UV ışınlaması sırasında ortam içinde mevcut olması mümkündür. Burada sunulan tekniğin potansiyel kültürü altında hücreleri Coculture sistemlerini inşa veya keyfi işlemek için desenleme çoklu hücre tiplerinde kullanılabilir.
Introduction
Yarıiletken litografi süreçleri ve türevleri – Böyle fotolitografi 1,2, elektron ışını litografi 3-6 ve 7-10 yazdırma microcontact olarak – şimdi tanımlanmış bir konum ve geometri yaşayan hücrelerin büyümesini hücre biyolojisinde kurulmuş bir araç haline gelmiştir. Model verme yöntemi, permisif olmayan arka plan hücre permisif kaplamanın mikro ada oluşan mikrofabrike substratların kullanımına dayanır. Bu gibi alt-tabaka desen hücreleri için bir şablon olarak hizmet vermektedir. Bu teknolojiler bize hücrelerinin içsel özelliklerinin ayıklamak ve hücre bazlı ilaç tarama 11 verimini artırmak için, bir tek ve çok hücresel düzeyde hücreleri ve bunların fonksiyonlarını mühendisi yeni yöntemler sağlamıştır.
Şablon desen geometrisi, yani yerinde değişmiş olabilir eğer hücreler s kültüre iken derecesi serbestlik hücre desenleme büyük ölçüde, artıracak, sert bir. Atmosferde veya vakumda örnekleri işleme sinyalinden oluşumu için olan klasik yöntemler, doğrudan, burada uygulanamamaktadır. Bu nedenle, çeşitli yeni yüzey modifikasyon teknikleri sadece birkaç isim için, fotoreaktif bileşikler 12,13 veya lazer ablasyon 5,14 tarihinde, örneğin, dayandığı öne sürülmüştür. Önerilen yöntemler güzel Choi ve ark., 16 ile ve Nakanishi'nin 17 tarafından daha yakın. Robertus ark 15 gözden ve oylandı.
İşte bu makalede, biz bir titanyum dioksit organik moleküllerin fotokatalitik ayrışma yararlanır in-situ yüzey modifikasyonu, (TiO2) yüzey 18,19 yeni bir protokol açıklar. Bu yöntemde, bir TiO2 filmi cam alt tabaka ve hücreleri arabirimleri, organik film arasında eklenir ve organik film yerel olarak ultraviyole (UV) ışınıma tabi tutulması işlemiyle in situ parçalanırÇevrede bir bölge (λ <388 nm) ışık. Yeni protokolü hücre dışı matris proteinleri ve canlı hücreler, hem ex situ ve in situ micropatterns oluşturmak için kullanılabileceğini göstermektedir. TiO2 hücre kültürü deneylerinde tanıtmak kolaylığına özellikleri olan, biyolojik olarak uyumlu, kimyasal olarak stabil, optik olarak saydamdır. Bu protokol, hücre kültürü ortamında hücre kültürü iskeleleri değiştirmek için bir malzeme bilimi tabanlı bir alternatif sunuyor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut protokolde, TiO2 filmi RF-manyetik alanda sıçratma tarafından kuruldu. Bize tekrarlanabilir bir alt-nm pürüzlülüğü ile fotokatalitik TiO2 filmi hazırlamak için izin verir çünkü biz birikimi bu yöntemi tercih. Püskürtülerek bırakma süreçleri malzeme bilim adamları ve mühendisleri elektronik tanıdık olmasına rağmen, biyologlar oldukça erişilebilir olmayabilir. Bu durumda, spin-kaplı TiO2 filmi alternatif bir seçenek 23 olacaktır. Bu yöntem…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors thank Mr. Kotaro Okubo for the kind assistance with SEM imaging. This work was supported by the Japan Society for the Promotion of Science Grant-in-Aid for Basic Research (B) (20310069), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (25880021), and by research grants from the Kurata Memorial Hitachi Science and Technology Foundation and the Nippon Sheet Glass Foundation for Materials Science and Engineering.
Materials
| Glass coverslip | Warner Instruments | CS-15R15 | 15 mm, #1.5 thickness |
| Diamond scriber | Ogura Jewel Industry | D-Point Pen | |
| RF sputtering system | ANELVA | SPC350 | |
| TiO2 sputtering target | Kojundo Chemical Lab | Titanium (IV) oxide, target | Purity, 99.9% |
| Plasma reactor | Yamato | PR301 | |
| n-octadecyltrichlorosilane (OTS) |
Aldrich | 104817 | |
| Toluene | Wako | 204-01866 | |
| Tissue-culture dish (35 mm) | Greiner | 627160 | |
| Tissue-culture dish (60 mm) | BD Falcon | 353002 | |
| Type-IV collagen | Nitta Gelatin | Cellmatrix Type IV | |
| D-PBS | Gibco | 14190-144 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) | Gibco | 11885-084 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 12483-020 | Heat-inactivate and pass through a 0.22 mm filter before use |
| Horse serum | Gibco | 26050-088 | Pass through a 0.22 mm filter before use |
| Penicillin-streptomycin (100x) | Nacalai tesque | 26253-84 | |
| 7S nerve growth factor (NGF) | Alomone Labs | N-130 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| EDTA | Dojindo | N001 | Stock solution in 0.5 M |
| TiO2 nanoparticle | Tayca | TKD-701 |
Riferimenti
- Hughes, M. A., Brennan, P. M., Bunting, A. S., Shipston, M. J., Murray, A. F. Cell Patterning on Photolithographically Defined Parylene-C: SiO2 Substrates. J. Vis. Exp. (85), e50929 (2014).
- Kleinfeld, D., Kahler, K. H., Hockberger, P. E. Controlled Outgrowth of Dissociated Neurons on Patterned Substrates. J. Neurosci. 8, 4098-4120 (1988).
- Pensen, D., Heinz, W. F., Werbin, J. L., Hoh, J. H., Haviland, D. B. Electron Beam Patterning of Fibronectin Nanodots that Support Focal Adhesion Formation. Soft Matter. 3, 1280-1284 (2007).
- Tanii, T., et al. Application of Organosilane Monolayer Template to Quantitative Evaluation of Cancer Cell Adhesive Ability. Jpn. J. Appl. Phys. 50, 06GL01 (2011).
- Yamamoto, H., et al. In-Situ Guidance of Individual Neuronal Processes by Wet Femtosecond Laser Processing of Self-Assembled Monolayers. Appl. Phys. Lett. 99, 163701-1610 (2011).
- Yamamoto, H., et al. Differential Neurite Outgrowth is Required for Axon Specification by Cultured Hippocampal Neurons. J. Neurochem. 123, 904-910 (2012).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J. Vis. Exp. (22), e1065 (2008).
- Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement. J. Vis. Exp. (55), e3164 (2011).
- Singhvi, R., et al. Engineering Cell Shape and Function. Science. 264, 696-698 (1126).
- Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. Geometric Control of Cell Life and Death. Science. 276, 1425-1428 (1997).
- Degot, S., et al. Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects using Micropatterned Cells. J. Vis. Exp. (46), e2514 (2010).
- Nakanishi, J., et al. Photoactivation of a Substrate for Cell Adhesion under Standard Fluorescence Microscopes. J. Am. Chem. Soc. 126, 16314-16315 (2004).
- Kim, M., et al. Addressable Micropatterning of Multiple Proteins and Cells by Microscope Projection Photolithography Based on a Protein Friendly Photoresist. Langmuir. 26, 12112-12118 (2010).
- Deka, G., Okano, K., Kao, F. -. J. Dynamic Photopatterning of Cells In Situ by Q-Switched Neodymium-Doped Yttrium Ortho-Vanadate. Laser. J. Biomed. Opt. 19, 011012 (2014).
- Robertus, J., Browne, W. R., Feringa, B. L. Dynamic Control over Cell Adhesive Properties using Molecular-Based Surface Engineering Strategies. Chem. Soc. Rev. 39, 354-378 (2010).
- Choi, I., Yeo, W. -. S. Self-Assembled Monolayers with Dynamicity Stemming from (Bio)chemical Conversions: From Construction to Application. ChemPhysChem. 14, 55-69 (2013).
- Nakanishi, J. Switchable Substrates for Analyzing and Engineering Cellular Functions. Chem. Asian J. 9, 406-417 (2014).
- Yamamoto, H., et al. In Situ Modification of Cell-Culture Scaffolds by Photocatalytic Decomposition of Organosilane Monolayers. Biofabrication. 6, 035021 (2014).
- Sekine, K., Yamamoto, H., Kono, S., Ikeda, T., Kuroda, A., Tanii, T. Surface Modification of Cell Scaffold in Aqueous Solution using TiO2 Photocatalysis and Linker Protein L2 for Patterning Primary Neurons. e-J. Surf. Sci. Nanotech. 13, 213-218 (2015).
- Arima, Y., Iwata, H. Effects of Surface Functional Groups on Protein Adsorption and Subsequent Cell Adhesion using Self-Assembled Monolayers. J. Mater. Chem. 17, 4079-4087 (2007).
- Fujishima, A., Zhang, X., Tryk, D. A. TiO2 Photocatalysis and Related Surface Phenomena. Surf. Sci. Rep. 63, 515-582 (2008).
- Sigal, G. B., Mrksich, M., Whitesides, G. M. Effect of Surface Wettability on the Adsorption of Proteins and Detergents. J. Am. Chem. Soc. 120, 3464-3473 (1998).
- Zhang, X., et al. A Transparent and Photo-Patternable Superhydrophobic Film. Chem. Commun. 2007, 4949-4951 (1039).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing Hippocampal Neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
