בידול של הקו הסלולרי SH-SY5Y האדם נוירובלסטומה

Summary

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

Abstract

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease.

The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods^1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

Introduction

היכולת להשתמש במערכות מודל במבחנה שיפרה מאוד בתחומי נוירוביולוגיה מדעי המוח. תאים בתרבית לספק פלטפורמה יעילה לאפיין פונקציונליות חלבון מנגנונים מולקולרי תופעות ספציפיות בסיסיות, להבין את הפתולוגיה של מחלות וזיהומים, וכדי לבצע הערכות בדיקות סמים ראשוניות. בנוירוביולוגיה, הסוגים העיקריים של מודלי תרבית תאים כוללים תרבויות עצביות עיקריות נגזרו חולדות ועכברים, שורות תאי נוירובלסטומה כגון תאי העכברוש B35 ^5, בתאים עכבר נוירו-2A ^6, ותאי PC12 עכברוש ^7. למרות השימוש של שורות תאים כאלה התקדמה בתחום מזה, אך קיימים מספר גורמים מבלבלים הקשורים בטיפול הלא-אנושי תאים ורקמות. אלה כולל מינים ספציפי הבנת הבדלים בתהליכי חילוף חומרים, פנוטיפים של ביטוי מחלה, בפתוגנזה בהשוואה לבני אדם. כמו כן, חשוב לציין כימחדש הבדלים משמעותיים בין עכבר ביטוי גנים אנושיים ואיתות גורם שעתוק, המדגישות את המגבלות של מודלים מכרסמים ואת החשיבות של הבנה אשר מסלולים שמורה בין מכרסמים ובני אדם ^8-11. אחרים המועסקים השימוש של שורות תאים עצביים האנושי כולל N-Tera-2 (NT2) בקו האנושי teratocarcinoma התא בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרה (iPSCs). שורות תאים אלה מספקים מודל טוב במבחנת מערכות אדם. עם זאת, התמיינות של תאי NT2 עם חומצה רטינואית (RA) תוצאות בדור של אוכלוסייה המעורבת של נוירונים, האסטרוציטים, ותאי גלייה רדיאלי ^12, דבר מחייב צעד טיהור נוסף כדי להשיג אוכלוסיות טהורות של נוירונים. בנוסף, תאי NT2 להפגין קריוטיפ משתנה מאוד ^13, עם יותר מ -60 כרומוזומים 72% של תאים. iPSCs להפגין השתנות בידול בין שורות תאים שונות, ונבדלים זה מזה יעיל בידול ^14. לכן רצוי שיהיה מודל תאים עצבי אדם עקבי לשחזור כדי להשלים חלופות אלה.

SH-SY5Y תאים דמויי neuroblast הם subclone של הקו הסלולרי נוירובלסטומה הורית SK-N-SH. שורת תא ההורים נוצרה בשנת 1970 מתוך ביופסית מח עצם המכיל את שני neuroblast דמוי תאים דמויים אפיתל ^15. יש תאי SH-SY5Y קריוטיפ יציב המורכב של 47 כרומוזומים, והוא יכול להיות מובחן ממצב neuroblast הדמוי אל הנוירונים שמהם מתפתחים שורה באמצעות מגוון רחב של מנגנונים שונים כולל שימוש RA, אסטרים phorbol, ו neurotrophins הספציפי כגון מוח נגזר גורם נוירוטרופי (BDNF). ראיות לפני עולה כי שימוש בשיטות שונות ניתן לבחור עבור תת נוירונים ספציפיים כגון אדרנרגיים, כולינרגית, ו נוירונים דופאמינרגיים ^16,17. ההיבט השני הזה גורם לתאי SH-SY5Y שימושי עבור מספר רב של ניסויים לנוירוביולוגיה.

ontent "> מספר מחקרים הראו ההבדלים חשובים בין תאי SH-SY5Y במדינות המובחנות בדיל שלהם. כאשר תאי SH-SY5Y הם מובחנים, הם מתרבים במהירות להיראות בלתי מקוטב, עם מעט מאוד, תהליכים קצרים. הם לרוב גדלים בגושים ולהביע סמנים המעידים על נוירונים בשלה ^18,19. כאשר בדיל, תאים אלה להאריך ארוכים, מסועפים תהליכים, ירידה בהתרבות, ובמקרים מסוימים לקטב ^2,18. תאי SH-SY5Y בדיל באופן מלא כבר הוכיחו בעבר להביע מגוון של סמנים שונים של נוירונים בוגרים לרבות גידול הקשורים החלבון (GAP-43), גרעינים עצביים (NeuN), synaptophysin (SYN), הסינפטי שלפוחית ​​חלבון II (SV2), נוירון אנולאז ספציפי (NSE) ו microtubule הקשורים החלבון (MAP) ^2,16,17,20, ואת חוסר ביטוי של סמנים גליה כגון חלבון גליה fibrillary חומצי (GFAP) ^4. ב תמיכה נוספת שהבדילו SH-SY5Y תאים represeNT אוכלוסייה עצבית הומוגנית, הסרת BDNF התוצאה הסלולר אפופטוזיס ^4. הדבר מצביע על כך ששיעור ההישרדות של תאי SH-SY5Y בדיל תלוי בגורמים תזונתיים, בדומה להבשיל נוירונים.

השימוש בתאי SH-SY5Y גדל מאז subclone הוקם בשנת 1978 ^3. כמה דוגמאות של השימוש שלהם כוללות חוקרת מחלת פרקינסון ^17, מחלת אלצהיימר ^21, ו בפתוגנזה של זיהום ויראלי כולל poliovirus ^22, enterovirus 71 (EV71) ^23,24 אבעבועות רוח, שלבקת חוגרת, וירוס (VZV) ^1, ציטומגלווירוס אדם ^25, ו נגיף הרפס סימפלקס (HSV) ^2,26. חשוב לציין כי מספר מחקרים באמצעות תאי SH-SY5Y השתמשו בתאים אלה בצורתם המובחנת, במיוחד בתחום neurovirology ^27-36. ההבדל הפנוטיפ הנצפה של מובחן לעומת תאי SH-SY5Y בדיל מעלה את שאלת wheיס את התקדמות הזיהום נצפה יהיה שונה נוירונים בדיל בוגרים. לדוגמה, תאים SH-SY5Y הבדיל יש יעילות גבוהה יותר של ספיגת HSV-1 לעומת תאים שלא עברו התמיינות, SH-SY5Y מתרבים, אשר יכול להיות בגלל חוסר הקולטנים אשר נקלטות HSV ולווסת הכניסה על תאים SH-SY5Y מובחן ^2. לכן זה קריטי כי בעת תכנון ניסוי התמקד בבדיקת נוירונים במבחנה, תאים SH-SY5Y צריך להיות מובחן על מנת לקבל את התוצאות המדויקות ביותר עבור תרגום השוואה למודלים in vivo.

פיתוח שיטה אמינה לייצר תרביות נוירונים אדם הוא הכרחי כדי לאפשר לחוקרים לבצע ניסויי translational במדויק מודל מערכת עצבים אנושי. הפרוטוקול המובא כאן הוא הליך תוחם מומלצים נגזר שיטות קודמות ^1-4 להעשיר נוירונים אדם נחלקיםבאמצעות חומצה רטינואית.

Protocol

1. שיקולים כלליים ראה טבלה של חומרים / ציוד כדי לקבל רשימה של ריאגנטים הצורך. ביצוע כל הצעדים בתנאים aseptic קפדנית. השתמש בסרום שור עובר חום המומת (hiFBS) עבור כל הכנות מדיה הכולל?…

Representative Results

נכון לעכשיו, ישנם מקרים רבים בתחום נוירוביולוגיה neurovirology שבו תאים SH-SY5Y מובחן נמצאים בשימוש כמודל פונקציונלי עבור נוירונים האדם 27-36, וחשוב מכך, תאים שלא עברו התמיינות עשוי היעדר פנוטיפים כגון ספיגת ויראלי אופטימלי 2 כי הם הכרחי פרשנות מדויקת. זה קריטי, כי בע…

Discussion

בפרוטוקול לעיל מספק שיטה פשוטה לשחזור כדי ליצור תרביות נוירונים אדם הומוגנית ובת קיימא. פרוטוקול זה מנצל טכניקות ושיטות עבודה המשלבים מספר שיטות שפורסמו בעבר ^1-4 ומטרתה להתוות את שיטות העבודה המומלצות של כל אחד. התמיינות של תאי SH-SY5Y מסתמכים על קיפוח בסרום הדרגת?…

Materials

B-27	Invitrogen	17504-044	See Table 1 for preparation
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	Sigma	SRP3014 (10ug)/B3795 (5ug)	See Table 1 for preparation
dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP)	Sigma	D0627	See Table 1 for preparation
DMSO	ATCC	4-X	–
Minimum Essential Medium Eagle (EMEM)	Sigma	M5650	–
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03	See Table 1 for preparation
GlutamaxI	Life Technologies	35050-061	–
Glutamine	Hyclone	SH30034.01	–
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	BP366-1	See Table 1 for preparation
MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution	Sigma	E0282	See step 11 of the protocol
Neurobasal	Life Technologies	21103-049	–
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)	Life Technologies	15140-122	–
Retinoic acid (RA)	Sigma	R2625	Should be stored in the dark at 4° C because this reagent is light sensitive
SH-SY5Y Cells	ATCC	CRL-2266	–
0.5% Trypsin + EDTA	Life Technologies	15400-054	–
Falcon 35mm TC dishes	Falcon (A Corning Brand)	353001	–