A diferenciação da linha celular SH-SY5Y humanas de neuroblastoma

Summary

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

Abstract

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease.

The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods^1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

Introduction

A capacidade de utilizar em sistemas modelo in vitro melhorou substancialmente nos domínios da neurobiologia e as neurociências. Células em cultura fornecer uma plataforma eficiente para caracterizar a funcionalidade de proteínas e mecanismos moleculares subjacentes fenômenos específicos, para entender a patologia de doenças e infecções, e para realizar avaliações preliminares de testes de drogas. In Neurobiology, os principais tipos de modelos de culturas de células neuronais primárias incluem culturas derivadas de ratos e murganhos, e linhas celulares de neuroblastoma, tais como células B35 de rato ^5, Neuro-2A ^6, células de rato, e células PC12 de rato ^7. Embora a utilização de tais linhas celulares tem avançado de forma significativa do campo, há vários factores de confusão associados com a manipulação de células e de tecidos não-humanos. Estes incluem espécies específicas compreender as diferenças nos processos metabólicos, fenótipos de manifestação da doença e patogênese quando comparado aos seres humanos. É também importante notar que are diferenças significativas entre mouse e expressão do gene humano e sinalização fator de transcrição, destacando as limitações dos modelos de roedores e a importância de compreender as vias metabólicas que são conservadas entre roedores e humanos ^8-11. Outros têm utilizado o uso de linhas de células neuronais humanos, incluindo o N-Tera-2 (NT2), linha celular de teratocarcinoma humano e células estaminais pluripotentes indutíveis (iPSCs). Estas linhas celulares fornecem bons modelos para sistemas in vitro humanos. No entanto, a diferenciação de células NT2 com ácido retinóico (RA) resulta na geração de uma população mista de neurónios, astrócitos e células gliais radiais ^12, que necessitam de um passo de purificação adicional para obtenção de populações puras de neurónios. Além disso, as células NT2 demonstrar um cariótipo altamente variável ^13, com maior do que 60 cromossomas em 72% das células. iPSCs demonstram a variabilidade na diferenciação entre as diferentes linhas de células e diferenciação variar em eficiência ^14. Por conseguinte, é desejável ter um modelo celular neuronal humana consistente e reprodutível para complementar estas alternativas.

SH-SY5Y células neuroblastos-like são um subclone da linha celular de neuroblastoma parentais SK-N-SH. A linha de células parental foi gerado em 1970 a partir de uma biópsia de medula óssea que contém as células epiteliais do tipo ^{15-neuroblastos} como e. As células SH-SY5Y ter um cariótipo estável que consiste de 47 cromossomas, e podem ser diferenciados a partir de um estado de neuroblastos-como em neurónios humanos maduros através de uma variedade de diferentes mecanismos, incluindo o uso de AR, ésteres do forbol, e neurotrofinas específicas, tais como cérebro-derivado factor neurotrófico (BDNF). Antes evidência sugere que a utilização de diferentes métodos podem seleccionar para os subtipos de neurónios adrenérgicos específicos, tais como, colinérgico, e neurónios dopaminérgicos ^16,17. Este último aspecto torna as células SH-SY5Y úteis para uma variedade de experiências de neurobiologia.

onteúdo "> Vários estudos notaram diferenças importantes entre as células SH-SY5Y em seus estados indiferenciados e diferenciadas. Quando as células SH-SY5Y são indiferenciadas, eles rapidamente proliferar e parecem ser não-polarizada, com muito poucos processos, curtos. Eles geralmente crescem em aglomerados e expressam marcadores de neurónios imaturos indicativos ^18,19. Quando diferenciadas, estas células estender ramificada longa processos, a diminuição da proliferação e, em alguns casos polarizar ^2,18. As células SH-SY5Y completamente diferenciadas foram anteriormente demonstrado para expressar um variedade de diferentes marcadores de neurónios maduros incluindo proteína associada ao crescimento (GAP-43), núcleos neuronais (NeuN), sinaptofisina (SYN), sináptica proteína vesicular II (SV2), a enolase específica neuronal (NSE) e microtúbulos proteína associada (MAP) ^2,16,17,20, e a falta de expressão de marcadores gliais, tais como a proteína glial fibrilar ácida (GFAP) ^4. Em mais apoio diferenciadas que as células SH-SY5Y represeNT uma população neuronal homogénea, a remoção de BDNF resulta em apoptose celular ^4. Isto sugere que a sobrevivência de células SH-SY5Y diferenciadas é dependente de factores tróficos, semelhantes a neurónios maduros.

Utilização de células SH-SY5Y aumentou desde o subclone foi estabelecida em 1978 ^3. Alguns exemplos da sua utilização incluem a investigação da doença de Parkinson ^17, a doença de Alzheimer ^21, e a patogénese da infecção virai, incluindo poliovírus ^22, enterovírus 71 (EV71) ^23,24 , vírus da varicela-zoster (VZV) ^1, citomegalovírus humano ^25, e vírus do herpes simplex (HSV) ^2,26. É importante notar que diversos estudos utilizando células SH-SY5Y foram utilizadas estas células na sua forma indiferenciada, especialmente no campo da neurovirology ^27-36. A diferença no fenótipo observado de indiferenciada contra células SH-SY5Y diferenciadas levanta a questão de wheterap a progressão da infecção observada seria diferente em neurónios diferenciados maduros. Por exemplo, as células SH-SY5Y diferenciadas têm uma maior eficiência de HSV-1 captação versus, em proliferação células SH-SY5Y indiferenciadas, que pode ser devido a uma falta de receptores de superfície que ligam o HSV e modulam a entrada em indiferenciadas células SH-SY5Y ^2. Portanto, é fundamental que ao projetar um experimento voltado a testar os neurônios in vitro, as células SH-SY5Y deve ser diferenciada a fim de obter os resultados mais precisos para a tradução e comparação de modelos in vivo.

O desenvolvimento de um método confiável para gerar culturas neuronais humanos é imperativo para permitir que os investigadores para realizar experimentos tradução que modelar com precisão o sistema nervoso humano. O protocolo aqui apresentado é um processo que delineia as melhores práticas derivadas de métodos anteriores ^1-4 para o enriquecimento em neurónios humanos que são diferenciadosutilizando ácido retinóico.

Protocol

1. Considerações Gerais Veja a Tabela de materiais / equipamentos para uma lista de reagentes necessários. Execute todas as etapas sob condições assépticas rigorosas. Use de soro fetal bovino inactivado pelo calor (hiFBS) para todos os meios de comunicação que incluem preparações de FBS. Para aquecer-inactivate, aquecer uma aliquota de 50 ml de FBS a 56 ° C durante 30 min, invertendo a cada 10 min (ver também a Tabela 1). Nota: Qu…

Representative Results

Neste momento, existem muitos casos na área da neurobiologia e neurovirology onde as células SH-SY5Y indiferenciadas estão sendo usados ​​como um modelo funcional para os neurônios humanos 27-36 e, mais importante, as células indiferenciadas podem não ter fenótipos, tais como a absorção viral óptima 2, que são necessário para a interpretação precisa. É crítico que, ao usar células SH-SY5Y ou qualquer outro sistema neuronal in vitro, as células são apropriadamente dif…

Discussion

O protocolo acima fornece um método simples e reprodutível para gerar culturas neuronais humanos homogéneos e viáveis. Este protocolo utiliza técnicas e práticas que integram vários métodos publicados anteriormente ^1-4 e tem como objetivo delinear as melhores práticas de cada um. Diferenciação de células SH-SY5Y depende de privação de soro gradual; a adição de ácido retinóico, factores neurotróficos e proteínas da matriz extracelular; e divisão de série para seleccionar para os neurônio…

Materials

B-27	Invitrogen	17504-044	See Table 1 for preparation
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	Sigma	SRP3014 (10ug)/B3795 (5ug)	See Table 1 for preparation
dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP)	Sigma	D0627	See Table 1 for preparation
DMSO	ATCC	4-X	–
Minimum Essential Medium Eagle (EMEM)	Sigma	M5650	–
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03	See Table 1 for preparation
GlutamaxI	Life Technologies	35050-061	–
Glutamine	Hyclone	SH30034.01	–
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	BP366-1	See Table 1 for preparation
MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution	Sigma	E0282	See step 11 of the protocol
Neurobasal	Life Technologies	21103-049	–
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)	Life Technologies	15140-122	–
Retinoic acid (RA)	Sigma	R2625	Should be stored in the dark at 4° C because this reagent is light sensitive
SH-SY5Y Cells	ATCC	CRL-2266	–
0.5% Trypsin + EDTA	Life Technologies	15400-054	–
Falcon 35mm TC dishes	Falcon (A Corning Brand)	353001	–