La differenziazione del SH-SY5Y neuroblastoma umano linea cellulare

Summary

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

Abstract

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease.

The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods^1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

Introduction

La possibilità di utilizzare in sistemi modello in vitro ha notevolmente migliorato i campi della neurobiologia e neuroscienze. Le cellule in coltura forniscono una piattaforma efficiente per caratterizzare la funzionalità delle proteine ​​e dei meccanismi molecolari alla base dei fenomeni specifici, per comprendere la patologia di malattie e infezioni, e di effettuare valutazioni preliminari di prova della droga. In neurobiologia, i principali tipi di modelli di coltura cellulare includono colture neuronali primarie derivate da ratti e topi, e le linee di cellule di neuroblastoma come le cellule di ratto B35 ^5, Neuro-2A cellule di topo ^6, e le cellule di ratto PC12 ^7. Sebbene l'uso di tali linee cellulari ha avanzato significativamente il campo, ci sono diversi fattori confondenti associati alla manipolazione cellule non e tessuti umani. Questi includono la comprensione specie-specifiche differenze nei processi metabolici, fenotipi di manifestazione della malattia, e la patogenesi rispetto agli esseri umani. E 'anche importante notare che ilre sono differenze significative tra il mouse e l'espressione genica umana e segnalazione fattore di trascrizione, mettendo in evidenza i limiti dei modelli di roditori e l'importanza di comprendere quali percorsi sono conservati tra i roditori e gli esseri umani ^8-11. Altri hanno impiegato l'uso di linee cellulari neuronali umani, tra cui la N-Tera-2 (NT2) linea di cellule umane teratocarcinoma e le cellule staminali pluripotenti inducibile (iPSCs). Queste linee cellulari forniscono buoni modelli per i sistemi umani di vitro. Tuttavia, la differenziazione delle cellule NT2 con acido retinoico (RA) comporta la generazione di una popolazione mista di neuroni, astrociti e cellule gliali radiali ^12, che richiedono un ulteriore stadio di purificazione per ottenere popolazioni pure di neuroni. Inoltre, cellule NT2 mostrano un cariotipo altamente variabile ^13, con più del 60 cromosomi in 72% di cellule. iPSCs dimostrano variabilità nella differenziazione tra diverse linee cellulari e variano in termini di efficienza differenziazione ^14. E 'quindi auspicabile disporre di un modello di cellule neuronali umane e riproducibile per completare queste alternative.

cellule neuroblasti-like SH-SY5Y sono un sottoclone della parentali cellule di neuroblastoma SK-N-SH. La linea cellulare parentale è stato generato nel 1970 da una biopsia del midollo osseo che contiene sia neuroblast-like e cellule ^{epiteliali-come} 15. cellule SH-SY5Y hanno un cariotipo stabile composto di 47 cromosomi, e possono essere differenziati da uno stato neuroblast simile in neuroni umani maturi attraverso una varietà di meccanismi diversi, tra cui l'uso di RA, esteri del forbolo, e neurotrofine specifici come derivato dal cervello fattore neurotrofico (BDNF). Prove Prima suggerisce che l'uso di metodi differenti può selezionare per specifici sottotipi neuronali come adrenergici, colinergici, e neuroni dopaminergici ^16,17. Quest'ultimo aspetto rende le cellule SH-SY5Y utili per una moltitudine di esperimenti neurobiologia.

ontent "> Diversi studi hanno notato importanti differenze tra le cellule SH-SY5Y nei loro stati indifferenziati e differenziati. Quando le cellule SH-SY5Y sono indifferenziate, che rapidamente proliferano e sembrano essere non polarizzata, con pochissime, processi brevi. Spesso crescono in gruppi ed esprimere marcatori indicativi di neuroni immaturi ^18,19. Quando differenziate, queste cellule si estendono lungo, ramificata processi, diminuzione della proliferazione, e in alcuni casi polarizzano ^2,18. cellule SH-SY5Y completamente differenziati sono stati precedentemente dimostrato di esprimere un varietà di diversi marcatori di neuroni maturi tra cui proteine ​​di crescita-associata (GAP-43), i nuclei neuronali (NeuN), synaptophysin (SYN), delle vescicole sinaptiche proteina II (SV2), enolasi neurone specifica (NSE) e proteine ​​associate ai microtubuli (MAP) ^2,16,17,20, e mancare espressione di marcatori gliali come la proteina silicea fibrillare gliale (GFAP) ^4. a ulteriore sostegno che differenziano le cellule SH-SY5Y RAPPRESEnt una popolazione neuronale omogenea, la rimozione di BDNF si traduce in apoptosi cellulare ^4. Questo suggerisce che la sopravvivenza delle cellule SH-SY5Y differenziate dipende da fattori trofici, simile a maturare neuroni.

L'utilizzo di cellule SH-SY5Y è aumentato rispetto alla subclone è stata fondata nel 1978 ^3. Alcuni esempi del loro uso includono indagare la malattia di Parkinson ^17, il morbo di Alzheimer ^21, e la patogenesi delle infezioni virali tra cui poliovirus ^22, enterovirus 71 (EV71) ^23,24 , virus varicella-zoster (VZV) ^1, citomegalovirus umano ^25, e il virus herpes simplex (HSV) ^2,26. È importante notare che diversi studi utilizzando cellule SH-SY5Y hanno utilizzato queste cellule nella loro forma indifferenziata, soprattutto nel campo della neurovirology ^27-36. La differenza nel fenotipo osservato di indifferenziata rispetto a cellule SH-SY5Y differenziate pone la questione di whether la progressione osservata dell'infezione sarebbe diversa nei neuroni differenziati maturi. Ad esempio, le cellule SH-SY5Y differenziati hanno una maggiore efficienza di HSV-1 captazione contro, proliferano le cellule SH-SY5Y indifferenziate, che può essere a causa della mancanza di recettori di superficie che legano HSV e modulano l'ingresso sul indifferenziate cellule SH-SY5Y ^2. È quindi importante che quando si progetta un esperimento focalizzata sui test neuroni di vitro, cellule SH-SY5Y dovrebbero essere differenziati al fine di ottenere i risultati più accurati per la traduzione e confronto di modelli in vivo.

Lo sviluppo di un metodo affidabile per generare colture neuronali umane è indispensabile per consentire ai ricercatori di effettuare esperimenti traslazionale che modellano con precisione il sistema nervoso umano. Il protocollo qui presentata è una procedura che delinea le best practice derivate da metodi precedenti ^1-4 per arricchire per i neuroni umani che si differenzianocon acido retinoico.

Protocol

1. Considerazioni generali Vedere la tabella dei materiali / attrezzature per un elenco di reagenti necessari. Eseguire tutte le operazioni in condizioni asettiche rigorose. Utilizzare siero fetale bovino inattivato al calore (hiFBS) per tutte le preparazioni dei media che includono FBS. Per riscaldare-inattivare, riscaldare a 50 ml aliquota di FBS a 56 ° C per 30 minuti, invertendo ogni 10 min (vedi anche tabella 1). Nota: …

Representative Results

Attualmente, ci sono molti casi nel campo della neurobiologia e neurovirology in cui le cellule SH-SY5Y indifferenziate vengono utilizzati come un modello funzionale per i neuroni umani 27-36, e, soprattutto, le cellule indifferenziate possono mancare fenotipi quali ottimale assorbimento virale 2 che sono necessario per la corretta interpretazione. È fondamentale che quando si usano cellule SH-SY5Y o qualsiasi altro sistema in vitro neuronale, le cellule sono opportunamente differenziate …

Discussion

Il protocollo di cui sopra fornisce un metodo semplice e riproducibile per generare colture neuronali umane omogenee e vitali. Questo protocollo utilizza tecniche e pratiche che integrano diversi metodi precedentemente pubblicati ^1-4 e mira a delineare le migliori pratiche di ciascuno. Differenziazione delle cellule SH-SY5Y si basa sulla progressiva deprivazione di siero; l'aggiunta di acido retinoico, fattori neurotrofici e proteine ​​della matrice extracellulare; e la divisione di serie per selezion…

Materials

B-27	Invitrogen	17504-044	See Table 1 for preparation
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	Sigma	SRP3014 (10ug)/B3795 (5ug)	See Table 1 for preparation
dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP)	Sigma	D0627	See Table 1 for preparation
DMSO	ATCC	4-X	–
Minimum Essential Medium Eagle (EMEM)	Sigma	M5650	–
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03	See Table 1 for preparation
GlutamaxI	Life Technologies	35050-061	–
Glutamine	Hyclone	SH30034.01	–
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	BP366-1	See Table 1 for preparation
MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution	Sigma	E0282	See step 11 of the protocol
Neurobasal	Life Technologies	21103-049	–
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)	Life Technologies	15140-122	–
Retinoic acid (RA)	Sigma	R2625	Should be stored in the dark at 4° C because this reagent is light sensitive
SH-SY5Y Cells	ATCC	CRL-2266	–
0.5% Trypsin + EDTA	Life Technologies	15400-054	–
Falcon 35mm TC dishes	Falcon (A Corning Brand)	353001	–