כימות תלת ממדיות של קוצים הדנדריטים מפירמידת נוירונים שמקורם בתאי גזע האנושי המושרה pluripotent
Summary
קוצים הדנדריטים של נוירונים פירמידה הם האתרים של רוב סינפסות המעוררות בקליפת המוח של יונקים. שיטה זו מתארת ניתוח כמו 3D של מורפולוגיות עמוד השדרה בנוירונים glutamatergic הפירמידה אנושיים בקליפת המוח שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרה.
Abstract
קוצים הדנדריטים הם בליטות קטנות שמתאימות לתאי פוסט-סינפטי של סינפסות מעוררות במערכת העצבים המרכזית. הם מופצים יחד דנדריטים. המורפולוגיה שלהם תלויה במידה רבה בפעילות עצבית, והם דינמיים. קוצים הדנדריטים לבטא קולטנים glutamatergic (קולטני AMPA וNMDA) על פני השטח שלהם וברמות של צפיפות פוסט-סינפטי. כל עמוד השדרה מאפשרת נוירון כדי לשלוט בפעילות מקומית ואת מדינתו באופן עצמאי. מורפולוגיות עמוד השדרה נחקרו רבות בתאים פירמידליים glutamatergic של קליפת המוח, באמצעות שני גישות in vivo ותרבויות עצביות המתקבלות מרקמות מכרסמים. יכולים להיות קשורים לתנאי נוירו אינדוקציה עמוד השדרה שינו והתבגרות, כפי שמוצגים בנוירונים בתרבית מכרסמים וניתוח כמותי חד-ממדי 1. המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול לניתוח כמותי של מורפולוגיות עמוד השדרה 3D באמצעות cortic אדםנוירונים אל שמקורם בתאי גזע עצביים (אבות קליפת המוח מאוחר). תאים אלה בתחילה התקבלו מתאי גזע pluripotent מושרה. פרוטוקול זה מאפשר הניתוח של מורפולוגיות עמוד השדרה בתקופות תרבות שונות, ועם השוואה אפשרית בין תאי גזע pluripotent מושרה מתקבלים מאנשים שליטה עם אלה המתקבלים מחולים במחלות פסיכיאטריות.
Introduction
קוצים הדנדריטים של תאי עצב בקליפת המוח הם פירמידה בליטות קטנות ודקים אשר מופצות לאורך הדנדריטים הבסיסיים ופסגה של תת העצבי אלה במכרסמים, קופים, ומוח אנושי. הם האתרים של רוב סינפסות מעוררות ולהציג פונקציות מרכזיות בלמידה ובתהליכים קוגניטיביים. המבנים מפורטים של קוצים הדנדריטים אדם נחקרו מבחינה טכנית על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים 2. עם זאת, גישה כזו היא זמן רב ומייצגת עומס עבודה כבדה. לאחרונה, שחזור תלת ממדים (3D) במורפולוגיה של קוצים הדנדריטים דווח בקליפת המוח אנושית באמצעות תוכנה ספציפית בשילוב לניתוח בעמוד השדרה במדריך גדול 3.
טכנולוגיה ירוקה חלבון פלואורסצנטי (GFP) מצמידים את immunofluorescence מייצגת כלי מדויק לזיהוי עמוד השדרה ומדידת צורה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. גישה זו יכולה להיות מיושמת בקלות לנוירונים בתרבית. האוVer, אין נתונים דווחו על הניתוח של התבגרות עמוד השדרה ומורפולוגיה על נוירונים אנושיים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרה (iPSC).
מטרת המחקר הייתה לתאר את פרוטוקול, המאפשר הדמיה בעמוד השדרה הדנדריטים מתאי עצב אנושיים בתרבית במבחנה. תיוג GFP, מיקרוסקופיה confocal וניתוח 3D עם מודול נימת Tracer של תוכנת Imaris שמשו בפרוטוקול הנוכחי. צעדי תרבות שנחוצים כדי להשיג תאי עצב בקליפת המוח glutamatergic של שכבות השניה לIV מתאי גזע עצביים (המל"ל) הם גם תאר בקצרה כאן. הפרוטוקול כולו לייצור המל"ל אדם כבר פורסם במקום אחר 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
כימות של תכונות מורפולוגיות של נוירונים פירמידה הסתמכה על התוכנה. ממשק נימת Tracer שימש לפילוח של נוירונים וקוצים, ואת מודול XT שימש לניתוח שלהם.
כדי לנתח את הדיוק של הטכניקה שלנו, אנחנו בהשוואה ראשונה פרמטרים שנמדדו מורפולוגיים (אור…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the Institut Pasteur, the Bettencourt-Schueller foundation, Centre National de la Recherche Scientifique, University Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), the Conny-Maeva Charitable Foundation, the Cognacq Jay Foundation, the Orange Foundation, and the Fondamental Foundation. L.G. is supported by an undergraduate fellowship from the Health Ministry. We acknowledge the help of BitPlane in particular Georgia Golfis, in the early stage of this work.
Materials
| PD-PBS (1X), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red | Gibco/ Life Technologies | 14190169 | |
| Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent | Sigma Aldrich | P4957 | |
| Mouse laminin | Dutscher Dominique | 354232 | |
| N2 Supplement | Gibco/ Life Technologies | 17502048 | |
| B-27 Supplement w/o vit A (50X) | Gibco/ Life Technologies | 12587010 | |
| DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I | Gibco/ Life Technologies | 31331028 | |
| Neurobasal Med SFM | Gibco/ Life Technologies | 21103049 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco/ Life Technologies | 31350-010 | |
| Pen-Steptomycin | Gibco/ Life Technologies | 15140-122 | |
| GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody | Gibco/ Life Technologies | A-6455 | |
| Horse serum | Gibco/ Life Technologies | 16050130 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit | Gibco/ Life Technologies | A11034 | |
| Polyclonal Anti-betaIII tubulin antibody | Millipore | AB9354 | |
| Coverglass 13 mm | VWR | 631-0150 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent avec DAPI | Gibco/ Life Technologies | P36931 | |
| Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid | Sigma Aldrich Chimie | P7949 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich Chimie | X100-100ML | |
| Human Fibroblasts | Coriell Cell Line Biorepository | GM 4603 and GM 1869 | Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss (Germany) | LSM 700 | |
| Imaris Software | Bitplane AG, Zurich | 6.4.0 version | Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary |
| Huygens Software | Huygens software, SVI, Netherlands | Pro version | Optional (for deconvolution testing) |
References
- Durand, C., et al. SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism. Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).
- Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. Non-synaptic dendritic spines in neocortex. Neuroscience. 145, 464-469 (2007).
- Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions. Cerebral Cortex. 23 (8), 1798-1810 (2013).
- Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).
- Avale, M. E., et al. Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion. Proceedings of National Academy of Science USA. 105 (41), 15991-15996 (2008).
- Xie, Z., et al. Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7. Journal of Neuroscience. 28 (24), 6079-6091 (2008).
- Srivastava, D. P., et al. Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone. Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35964-35974 (2012).
- Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons. Journal of Visualized Experiments. (53), e2794 (2011).
- Brennand, K. J., Gage, F. H. Modeling psychiatric disorders through reprogramming. Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 26-32 (2012).
- Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).
- Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
- Stein, J. L., et al. Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells. Neuron. 83, 69-86 (2014).
- Sivapatham, R., Zheng, X. Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling. Methods in Molecular Biology. , (2014).
- Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).
- Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (4), e1997 (2008).
