الكمي ثلاثي الأبعاد من شجيري العمود الفقري من الخلايا العصبية الهرمية المستمدة من صنع الإنسان المحفزة الخلايا الجذعية
Summary
العمود الفقري شجيري من الخلايا العصبية الهرمية هي مواقع معظم نقاط الاشتباك العصبي مثير في الثدييات قشرة الدماغ. يصف هذا الأسلوب التحليل الكمي 3D من الأشكال التضاريسية العمود الفقري في القشرية الخلايا العصبية الهرمية glutamatergic الإنسان المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة.
Abstract
العمود الفقري شجيري هي نتوءات صغيرة التي تتوافق مع مقصورات بعد متشابك من نقاط الاشتباك العصبي مثير في الجهاز العصبي المركزي. وهي موزعة على طول التشعبات. مورفولوجيا يعتمد إلى حد كبير على نشاط الخلايا العصبية، وهي ديناميكية. العمود الفقري شجيري تعبر عن مستقبلات glutamatergic (أمبا ومستقبلات NMDA) على سطحها وعلى مستوى كثافة بعد المشبكي. كل العمود الفقري يسمح الخلايا العصبية للسيطرة على نشاط الدولة والمحلي بشكل مستقل. وقد الأشكال التضاريسية العمود الفقري درس على نطاق واسع في الخلايا الهرمية glutamatergic من القشرة الخارجية للدماغ، وذلك باستخدام كلا النهجين في الجسم الحي والثقافات العصبية التي تم الحصول عليها من الأنسجة القوارض. ظروف عصبية مرضية يمكن أن تكون مرتبطة إلى تغير تحريض العمود الفقري والنضج، كما هو مبين في القوارض الخلايا العصبية مثقف والتحليل الكمي ذات بعد واحد 1. توضح هذه الدراسة بروتوكول للتحليل الكمي 3D من الأشكال التضاريسية العمود الفقري باستخدام cortic الإنسانالخلايا العصبية آل المستمدة من الخلايا الجذعية العصبية (الأسلاف القشرية في وقت متأخر). تم الحصول على هذه الخلايا في البداية من الخلايا الجذعية المحفزة. هذا البروتوكول يسمح للتحليل الأشكال التضاريسية العمود الفقري في فترات ثقافة مختلفة، ومع المقارنة الممكنة بين الخلايا الجذعية المحفزة التي تم الحصول عليها من الأفراد التحكم مع تلك التي تم الحصول عليها من المرضى الذين يعانون من الأمراض النفسية.
Introduction
العمود الفقري شجيري من الخلايا العصبية الهرمية القشرية هي نتوءات صغيرة ورقيقة والتي يتم توزيعها على طول التشعبات القاعدية وقمية من هذه الأنواع الفرعية العصبية في القوارض، الرئيسيات، والدماغ البشري. فهي مواقع لمعظم نقاط الاشتباك العصبي مثير وعرض وظائف أساسية في التعلم والعمليات المعرفية. الهياكل التفصيلية في العمود الفقري شجيري الإنسان تم دراستها فنيا من قبل المجهر الإلكتروني (2). ومع ذلك، فإن هذا النهج هو مضيعة للوقت، ويمثل عبء العمل الثقيل. وفي الآونة الأخيرة، تم الإبلاغ عن ثلاثي الأبعاد (3D) إعادة بناء مورفولوجية شجيري العمود الفقري في قشرة الدماغ البشري باستخدام برامج معينة مجتمعة لدليل كبير تحليل العمود الفقري 3.
الخضراء البروتين مضان (GFP) التكنولوجيا بالإضافة إلى المناعي تمثل أداة دقيقة لتحديد العمود الفقري وقياس الشكل بواسطة المجهر مضان. هذا النهج يمكن تطبيقها بسهولة على الخلايا العصبية مثقف. هاوالاصدار، تم الإبلاغ عن أي بيانات عن تحليل النضج العمود الفقري والتشكل على الخلايا العصبية البشرية المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة (التوجيهية).
وكان الهدف من هذه الدراسة لوصف البروتوكول الذي يسمح التصوير العمود الفقري شجيري من الخلايا العصبية البشرية المستزرعة في المختبر. تم استخدام العلامات GFP، متحد البؤر المجهري والتحليل 3D مع وحدة الشعيرة الراسم من البرامج Imaris في هذا البروتوكول. خطوات الثقافة التي هي ضرورية للحصول على الخلايا العصبية glutamatergic القشرية من طبقات من الثاني إلى الرابع من الخلايا الجذعية العصبية (NSC) هي أيضا لفترة وجيزة الموصوفة هنا. وقد تم بالفعل نشر بروتوكول كامل لإنتاج NSC الإنسان في أي مكان آخر 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
اعتمد الكمي من الميزات المورفولوجية من الخلايا العصبية الهرمية على البرنامج. تم استخدام واجهة الشعيرة الراسم لتقسيم الخلايا العصبية والعمود الفقري، وكان يستخدم وحدة XT لتحليلها.
لتحليل دقة تقنية لدينا، ونحن أول مقارنة قياس المع…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the Institut Pasteur, the Bettencourt-Schueller foundation, Centre National de la Recherche Scientifique, University Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), the Conny-Maeva Charitable Foundation, the Cognacq Jay Foundation, the Orange Foundation, and the Fondamental Foundation. L.G. is supported by an undergraduate fellowship from the Health Ministry. We acknowledge the help of BitPlane in particular Georgia Golfis, in the early stage of this work.
Materials
| PD-PBS (1X), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red | Gibco/ Life Technologies | 14190169 | |
| Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent | Sigma Aldrich | P4957 | |
| Mouse laminin | Dutscher Dominique | 354232 | |
| N2 Supplement | Gibco/ Life Technologies | 17502048 | |
| B-27 Supplement w/o vit A (50X) | Gibco/ Life Technologies | 12587010 | |
| DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I | Gibco/ Life Technologies | 31331028 | |
| Neurobasal Med SFM | Gibco/ Life Technologies | 21103049 | |
| 2-mercaptoethanol | Gibco/ Life Technologies | 31350-010 | |
| Pen-Steptomycin | Gibco/ Life Technologies | 15140-122 | |
| GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody | Gibco/ Life Technologies | A-6455 | |
| Horse serum | Gibco/ Life Technologies | 16050130 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit | Gibco/ Life Technologies | A11034 | |
| Polyclonal Anti-betaIII tubulin antibody | Millipore | AB9354 | |
| Coverglass 13 mm | VWR | 631-0150 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent avec DAPI | Gibco/ Life Technologies | P36931 | |
| Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid | Sigma Aldrich Chimie | P7949 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich Chimie | X100-100ML | |
| Human Fibroblasts | Coriell Cell Line Biorepository | GM 4603 and GM 1869 | Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss (Germany) | LSM 700 | |
| Imaris Software | Bitplane AG, Zurich | 6.4.0 version | Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary |
| Huygens Software | Huygens software, SVI, Netherlands | Pro version | Optional (for deconvolution testing) |
References
- Durand, C., et al. SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism. Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).
- Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. Non-synaptic dendritic spines in neocortex. Neuroscience. 145, 464-469 (2007).
- Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions. Cerebral Cortex. 23 (8), 1798-1810 (2013).
- Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).
- Avale, M. E., et al. Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion. Proceedings of National Academy of Science USA. 105 (41), 15991-15996 (2008).
- Xie, Z., et al. Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7. Journal of Neuroscience. 28 (24), 6079-6091 (2008).
- Srivastava, D. P., et al. Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone. Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35964-35974 (2012).
- Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons. Journal of Visualized Experiments. (53), e2794 (2011).
- Brennand, K. J., Gage, F. H. Modeling psychiatric disorders through reprogramming. Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 26-32 (2012).
- Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).
- Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
- Stein, J. L., et al. Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells. Neuron. 83, 69-86 (2014).
- Sivapatham, R., Zheng, X. Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling. Methods in Molecular Biology. , (2014).
- Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).
- Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (4), e1997 (2008).
