Summary

כימות תלת ממדיות של קוצים הדנדריטים מפירמידת נוירונים שמקורם בתאי גזע האנושי המושרה pluripotent

Published: October 10, 2015
doi:

Summary

קוצים הדנדריטים של נוירונים פירמידה הם האתרים של רוב סינפסות המעוררות בקליפת המוח של יונקים. שיטה זו מתארת ​​ניתוח כמו 3D של מורפולוגיות עמוד השדרה בנוירונים glutamatergic הפירמידה אנושיים בקליפת המוח שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרה.

Abstract

קוצים הדנדריטים הם בליטות קטנות שמתאימות לתאי פוסט-סינפטי של סינפסות מעוררות במערכת העצבים המרכזית. הם מופצים יחד דנדריטים. המורפולוגיה שלהם תלויה במידה רבה בפעילות עצבית, והם דינמיים. קוצים הדנדריטים לבטא קולטנים glutamatergic (קולטני AMPA וNMDA) על פני השטח שלהם וברמות של צפיפות פוסט-סינפטי. כל עמוד השדרה מאפשרת נוירון כדי לשלוט בפעילות מקומית ואת מדינתו באופן עצמאי. מורפולוגיות עמוד השדרה נחקרו רבות בתאים פירמידליים glutamatergic של קליפת המוח, באמצעות שני גישות in vivo ותרבויות עצביות המתקבלות מרקמות מכרסמים. יכולים להיות קשורים לתנאי נוירו אינדוקציה עמוד השדרה שינו והתבגרות, כפי שמוצגים בנוירונים בתרבית מכרסמים וניתוח כמותי חד-ממדי 1. המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול לניתוח כמותי של מורפולוגיות עמוד השדרה 3D באמצעות cortic אדםנוירונים אל שמקורם בתאי גזע עצביים (אבות קליפת המוח מאוחר). תאים אלה בתחילה התקבלו מתאי גזע pluripotent מושרה. פרוטוקול זה מאפשר הניתוח של מורפולוגיות עמוד השדרה בתקופות תרבות שונות, ועם השוואה אפשרית בין תאי גזע pluripotent מושרה מתקבלים מאנשים שליטה עם אלה המתקבלים מחולים במחלות פסיכיאטריות.

Introduction

קוצים הדנדריטים של תאי עצב בקליפת המוח הם פירמידה בליטות קטנות ודקים אשר מופצות לאורך הדנדריטים הבסיסיים ופסגה של תת העצבי אלה במכרסמים, קופים, ומוח אנושי. הם האתרים של רוב סינפסות מעוררות ולהציג פונקציות מרכזיות בלמידה ובתהליכים קוגניטיביים. המבנים מפורטים של קוצים הדנדריטים אדם נחקרו מבחינה טכנית על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים 2. עם זאת, גישה כזו היא זמן רב ומייצגת עומס עבודה כבדה. לאחרונה, שחזור תלת ממדים (3D) במורפולוגיה של קוצים הדנדריטים דווח בקליפת המוח אנושית באמצעות תוכנה ספציפית בשילוב לניתוח בעמוד השדרה במדריך גדול 3.

טכנולוגיה ירוקה חלבון פלואורסצנטי (GFP) מצמידים את immunofluorescence מייצגת כלי מדויק לזיהוי עמוד השדרה ומדידת צורה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. גישה זו יכולה להיות מיושמת בקלות לנוירונים בתרבית. האוVer, אין נתונים דווחו על הניתוח של התבגרות עמוד השדרה ומורפולוגיה על נוירונים אנושיים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרה (iPSC).

מטרת המחקר הייתה לתאר את פרוטוקול, המאפשר הדמיה בעמוד השדרה הדנדריטים מתאי עצב אנושיים בתרבית במבחנה. תיוג GFP, מיקרוסקופיה confocal וניתוח 3D עם מודול נימת Tracer של תוכנת Imaris שמשו בפרוטוקול הנוכחי. צעדי תרבות שנחוצים כדי להשיג תאי עצב בקליפת המוח glutamatergic של שכבות השניה לIV מתאי גזע עצביים (המל"ל) הם גם תאר בקצרה כאן. הפרוטוקול כולו לייצור המל"ל אדם כבר פורסם במקום אחר 4.

Protocol

1. עצבי תרבות הערה: תכנות מחדש פיברובלסטים בתאי גזע pluripotent, מחויבת לשושלת telencephalon הגב, גזירה, הגברה, ובנקאות של אבות קליפת המוח מאוחר (LCP) תוארה באל Boissart et 4. בידול עצבי של תאים כמו LCP-גם ביצע על פי אל Boissart et 4</s…

Representative Results

המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול סטנדרטי לכימות עמוד השדרה של דנדריטים תרבית של תאי עצב פירמידה נגזרים מiPSC. פרוטוקול זה מאפשר הניתוח של התבגרות עמוד השדרה על נוירונים אנושיים והשוואה האפשרית שלה עם ההתבגרות של עמוד השדרה בתרבויות עצביות מכרסם סטנדרטיים, כמו גם in vivo</…

Discussion

כימות של תכונות מורפולוגיות של נוירונים פירמידה הסתמכה על התוכנה. ממשק נימת Tracer שימש לפילוח של נוירונים וקוצים, ואת מודול XT שימש לניתוח שלהם.

כדי לנתח את הדיוק של הטכניקה שלנו, אנחנו בהשוואה ראשונה פרמטרים שנמדדו מורפולוגיים (אור…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was funded by the Institut Pasteur, the Bettencourt-Schueller foundation, Centre National de la Recherche Scientifique, University Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), the Conny-Maeva Charitable Foundation, the Cognacq Jay Foundation, the Orange Foundation, and the Fondamental Foundation. L.G. is supported by an undergraduate fellowship from the Health Ministry. We acknowledge the help of BitPlane in particular Georgia Golfis, in the early stage of this work.

Materials

PD-PBS (1X), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red Gibco/ Life Technologies 14190169
Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent Sigma Aldrich P4957
Mouse laminin Dutscher Dominique 354232
N2 Supplement Gibco/ Life Technologies 17502048
B-27 Supplement w/o vit A (50X) Gibco/ Life Technologies 12587010
DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I Gibco/ Life Technologies 31331028
Neurobasal Med SFM Gibco/ Life Technologies 21103049
2-mercaptoethanol Gibco/ Life Technologies 31350-010
Pen-Steptomycin Gibco/ Life Technologies 15140-122
GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody Gibco/ Life Technologies A-6455
Horse serum Gibco/ Life Technologies 16050130
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit  Gibco/ Life Technologies A11034
Polyclonal Anti-betaIII tubulin antibody Millipore AB9354
Coverglass 13 mm VWR 631-0150
Prolong Gold Antifade Reagent avec DAPI Gibco/ Life Technologies P36931
Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid Sigma Aldrich Chimie P7949
Triton X-100 Sigma Aldrich Chimie X100-100ML
Human Fibroblasts Coriell Cell Line Biorepository GM 4603 and GM 1869 Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA
Confocal laser scanning microscope Zeiss (Germany) LSM 700
Imaris Software Bitplane AG, Zurich 6.4.0 version Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary
Huygens Software Huygens software, SVI, Netherlands Pro version Optional (for deconvolution testing)

References

  1. Durand, C., et al. SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism. Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).
  2. Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. Non-synaptic dendritic spines in neocortex. Neuroscience. 145, 464-469 (2007).
  3. Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions. Cerebral Cortex. 23 (8), 1798-1810 (2013).
  4. Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).
  5. Avale, M. E., et al. Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion. Proceedings of National Academy of Science USA. 105 (41), 15991-15996 (2008).
  6. Xie, Z., et al. Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7. Journal of Neuroscience. 28 (24), 6079-6091 (2008).
  7. Srivastava, D. P., et al. Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone. Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35964-35974 (2012).
  8. Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons. Journal of Visualized Experiments. (53), e2794 (2011).
  9. Brennand, K. J., Gage, F. H. Modeling psychiatric disorders through reprogramming. Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 26-32 (2012).
  10. Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).
  11. Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. iPS cells: a game changer for future medicine. EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
  12. Stein, J. L., et al. Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells. Neuron. 83, 69-86 (2014).
  13. Sivapatham, R., Zheng, X. Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling. Methods in Molecular Biology. , (2014).
  14. Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome. Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).
  15. Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (4), e1997 (2008).

Play Video

Cite This Article
Gouder, L., Tinevez, J., Goubran-Botros, H., Benchoua, A., Bourgeron, T., Cloëz-Tayarani, I. Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (104), e53197, doi:10.3791/53197 (2015).

View Video