Eine schnelle und quantitative fluorimetrische Verfahren zur Protein-Targeting kleines Molekül als Wirkstoff-Screening
Summary
A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.
Abstract
Zeigen wir eine neue Wirkstoff-Screening-Verfahren zur Bestimmung der Bindungsaffinität von kleinen Arzneimittelmolekülen an ein Zielprotein durch Bilden Fluoreszenzgoldcluster (Au NCs) innerhalb der mit Wirkstoff beladenen Proteins, basierend auf den Differenzfluoreszenzsignal von der Au NCs emittiert. Albuminproteine wie humanes Serumalbumin (HSA) und Rinderserumalbumin (BSA) als die Modellproteinen ausgewählt ist. Vier kleinen Molekular Medikamente (zum Beispiel Ibuprofen, Warfarin, Phenytoin und Sulfanilamid) unterschiedlicher Bindungsaffinitäten zur Albumin-Proteine getestet. Es wurde gefunden, daß die Bildungsrate von fluoreszierenden Au NCs Inneren Wirkstoff beladen Albuminprotein unter denaturierenden Bedingungen (dh 60 ° C oder in Gegenwart von Harnstoff) langsamer ist als die in dem ursprünglichen Protein (ohne Arzneimittel) gebildet. Darüber hinaus ist die Fluoreszenzintensität der so gebildeten Nanokristalle festgestellt wird, umgekehrt an die Bindungsaffinitäten dieser Medikamente auf die Albuminproteine korreliert werden. Insbesondereje höher die Drogen-Protein-Bindungsaffinität, desto langsamer die Rate der Au NCs-Bildung und damit eine niedrigere Fluoreszenzintensität der erhaltenen Au NCs beobachtet. Die Fluoreszenzintensität der erhaltenen Au NCs stellt daher ein einfaches Maß der relativen Bindungsstärke von verschiedenen Medikamenten getestet. Dieses Verfahren ist auch erweiterbar auf die spezifischen Drogen-Protein-Bindungskonstante (K D), die durch einfache Variation der Wirkstoffgehalt im Protein an einer festen Proteinkonzentration vorbelastet messen. Die gemessenen Ergebnisse entsprechen auch die Verwendung anderer Prestige, sondern komplizierter Verfahren erhaltenen Werte.
Introduction
Serum Albumine, wie Humanserumalbumin (HSA) und Rinderserumalbumin (BSA) sind das häufigste Protein im Plasma und spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der osmotische Druck der Blutkammer. Sie werden auch als Trägerproteine für kleine Moleküle mit geringer Wasserlöslichkeit, wie Steroiden, Fettsäuren, Schilddrüsenhormone, und eine Vielzahl von Medikamenten erkannt. Die Bindungseigenschaft (beispielsweise Bindungsstellen, Bindungsaffinität oder die Stärke) dieser Moleküle an Albumine im Serum bildet ein wichtiges Thema in der Pharmakokinetik. 1-4 mehrere Analyseverfahren entwickelt worden, um die Bindungseigenschaften von verschiedenen Medikamenten zu untersuchen Albumine im Serum, beispielsweise Röntgenkristallographie, 5,6 kernmagnetische Resonanz (NMR), 7-11 und Oberflächenplasmonresonanz (SPR), 12,13 usw. Jedoch sind diese Verfahren entweder durch eine mühsame und zeitraubende Analyseprozess ist (Zwangs zB Wachstum von Einkristall-Röntgen kristalloGrafik-Studie), Erfordernis spezialisierte und teure Ausrüstung (SPR), oder in der Notwendigkeit von teuren Isotopenmarkierung (NMR) für die Erkennung. Es ist daher höchst wünschenswert, alternative Möglichkeiten zur kleinen molekularen Wirkstoff-Screening auf eine schnelle, unkomplizierte und kostengünstige Art und Weise zu entwickeln.
Gold-Nanocluster (Au NCs) sind eine spezielle Art von Nanomaterialien, die mehrere Zehnmetallatome mit einer Größe von weniger als 2 nm. 14-17 Sie haben umfangreiche Forschungsinteressen zogen enthalten aufgrund ihrer diskreten und größenabhängige elektronische Struktur, 18, 19 und molekularartigen Absorptionen und Emissionen. 20-23 Solche einzigartigen Materialeigenschaften, insbesondere die starke Fluoreszenz, haben diverse Anwendungen wie Sensorik und Bildgebung in biologischen Systemen. 24-32 Ultrasmall Fluoreszenz Au NCs können mit Hilfe der funktionellen Proteine synthetisiert werden gefunden, wie Serumalbumine, als Vorlage. 33 In einem typischen Protein-gestützten Synthese Au NCs, eine bestimmte Menge an Au-Salze werden zunächst innerhalb der Protein eingekapselt und anschließend durch das Protein selbst reduziert. Die reduzierende Fähigkeit des Proteins zugeschrieben wird, um funktionelle Aminosäurereste (zB Tyrosin), die durch eine Erhöhung des pH-Lösung alkalisch aktivierbaren Bestandteil enthält. Entfaltung der Proteinstruktur wird als ein kritischer Schritt für die Bildung von Au NCs betrachtet. Dies liegt daran, dass in einem ungefalteten Protein kann mehrere Reduktions funktionellen Gruppen zu den eingekapselten Au-Salzen ausgesetzt werden. Proteinentfaltung kann durch Wärmebehandlung oder durch Einwirkung von Denaturierungsmitteln erfolgen. Einführung von kleinen Molekül Medikamente können auch auf den Entfaltungsvorgang, dh Änderung der Mittelpunkt Denaturierungstemperatur und die Enthalpie der Entfaltung. 34,35 die Wirkung aller dieser Faktoren kann wiederum durch die Bildungskinetiken fluoreszierender Au NCs reflektiert und manifestieren die Fluoreszenzintensität der resultierenden Au NCs. 36
e_content "> Das Video zeigt das Verfahren zum Wirkstoff-Screening durch Synthetisieren Au NCs mit Wirkstoff beladenen Albuminproteine bei einer höheren Temperatur (60 ° C) oder in Gegenwart denaturierender Agenzien (zB Harnstoff). Die Fluoreszenzintensität der resultierenden Au NCs ist die Signalauslese. Zuerst Au NCs werden HSA und BSA-Vorlagen, auf 60 ° C oder in Gegenwart von Harnstoff behandelt wird synthetisiert, um zu zeigen, wie Proteinentfaltung (durch Wärmebehandlung oder Denaturierungsmitteln induziert) wirkt sich auf die Bildung Kinetik Au NCs. Zweitens Au NCs in Protein-Vorlagen mit unterschiedlichen Medikamenten vorbelastet synthetisiert und die Wirkstoffbeladung auf die relative Fluoreszenzintensitäten von resultierenden Au NCs sucht wird, das die Messung der relativen Bindungsstärke bereitzustellen. Schließlich wird der Au-NC-Wirkstoff-Screening-Protokoll für die modifizierte quantitative Messung der Wirkstoff-Protein-Bindungskonstante (K D) durch Variieren der Arzneistoffgehalt in dem Protein von einer festen Konzentration vorgespannt.Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt mehrere wichtige Schritte, die in diesem Verfahren markiert werden müssen. In das Protokoll der Screening der relativen Bindungsaffinität von verschiedenen kleinen molekularen Drogen, Schritte 3.1.2, 3.1.3 und 3.1.4 sind entscheidend für gute Ergebnisse zeigt einheitlichen Trend für die relative Bindungsstärke zu erhalten. In diesen Schritten, sollten die Maßnahmen der Zugabe von Chemikalien und Darstellung von Reaktionslösungen für die Messung, so schnell wie möglich sein, um die Zeitverzögerung Wirku…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Y.N.T. would like to acknowledge the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore for the financial support under the JCO CDA grant 13302FG063.
Materials
| Gold (III) chloride solution, 30% | Sigma-Aldrich | 484385 | Corrosive, irritant |
| Human serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A1887 | |
| Bovine Serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ibuprofen, 98% | Sigma-Aldrich | I4883 | |
| warfarin, 98% | Sigma-Aldrich | A2250 | |
| phenytoin | Sigma-Aldrich | PHR1139 | |
| sulphanilamide, 99% | Sigma-Aldrich | S9251 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RT5 | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| 384-well plate | Corning | ||
| 5 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 1000 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 100 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 5000 mL Eppendorf tips | |||
| 1000 mL Eppendorf tips | |||
| 100 mL Eppendorf tips | |||
| 1.5 mL micro tube | Eppendorf | ||
| 20 mL glass vial with screw cap | |||
| 4 mL glass vial with screw cap |
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