단백질 표적 소분자 약물 검사를위한 신속하고 정량적적인 형광 방법
Summary
A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.
Abstract
우리는 금 나노 결정에서 방출되는 차동 형광 신호에 기초하여 약물 – 로딩 단백질 내의 형광 금 나노 클러스터 (금 나노)를 형성함으로써 표적 단백질에 작은 약물 분자의 결합 친화도를 결정하기위한 새로운 약물 스크리닝 방법을 보여준다. 인간 혈청 알부민 (HSA)과 소 혈청 알부민 (BSA)과 같은 단백질은 알부민 단백질 모델로서 선택된다. 4 개의 작은 분자 약물 알부민 단백질에 다른 결합 친화도의 (예를 들어, 이부프로펜, 와파린, 페니토인 및 설파 닐 아미드)를 시험한다. 이는 변성 조건 (즉, 60 ° C 또는 우레아의 존재하에)하에 약물로드 알부민 단백질 내부 형광 금 나노 결정의 형성 비율은 (약물)없이 깨끗 단백질에 형성된 것보다 느리다는 것을 발견 하였다. 또한, 상기와 같은 나노 결정 형성의 형광 강도는 반비례 알부민이 단백질 약물의 결합 친화도에 상관 관계가 발견된다. 특히,금 나노 결정 형성 속도 느린 약물 – 단백질 결합 친 화성이 높은, 이렇게 얻어진 금 나노 낮은 형광 강도가 관찰된다. 얻어진 금 나노 결정의 형광 강도 테스트 따라서 다른 약물의 상대적인 결합 강도의 단순한 측정을 제공한다. 이 방법은 단순히 고정 된 단백질의 단백질 농도로 사전로드 약물 함량을 변화시킴으로써, 특정 약물 – 단백질 결합 상수 (K D)를 측정하기 위해 연장된다. 측정 결과는 다른 프레스하지만 더 복잡한 방법을 이용하여 얻어진 값과 잘 일치.
Introduction
인간 혈청 알부민 (HSA)과 소 혈청 알부민 (BSA)와 같은 혈청 알부민은 혈장에서 가장 풍부한 단백질이고 혈액 구획의 삼투압을 유지하는데 중요한 역할을한다. 또한 스테로이드와 같은 낮은 수용해도의 소분자, 지방산, 갑상선 호르몬, 약물의 광범위한 담체 단백질로서 인식된다. 바인딩 재산권 알부민 혈청하는 이들 분자의 (예를 들어, 친 화성 또는 강도를 결합, 결합 부위)의 약동학에 중요한 주제를 형성한다. 1-4 여러 분석 방법과 같은, 알부민 혈청 상이한 약물의 결합 특성을 연구하기 위해 개발되어왔다 X 선 결정학, 5,6- 핵 자기 공명 (NMR), 7-11 및 표면 플라즈몬 공명 (SPR), 12, 13 등 그러나, 이들 방법은 지루하고 시간 소모적 해석 처리 (하나에 의해 제한되는 예를 들면, X 선 crystallo위한 단결정 성장그래픽 연구), 전문 및 고가의 장비의 요구 사항 (SPR), 또는 검출을위한 비용이 많이 드는 동위 원소 표지 (NMR)을 필요로한다. 또한, 빨리 감기 직쇄, 비용 효율적인 방법으로 저분자 약물 스크리닝하는 다른 방법을 개발하는 것이 매우 바람직하다.
금 나노 클러스터 (금 나노)는 그들의 분리 및 크기에 의존하는 전자 구조, (18)에 그들은 광범위한 연구 관심을 받고있다 2 나노 미터. 14 ~ 17보다 작은 크기의 금속 원자의 수십 포함 된 나노 물질의 특별한 유형이다 20-23 이러한 독특한 재료의 특성, 특히 강한 형광이, 생물학적 시스템에서 감지 및 영상. 24-32 초소형 형광 금 나노 기능성 단백질을 사용하여 합성 할 수있는 등 다양한 응용 프로그램을 발견했다. (19)와 분자 등의 흡수 및 배출, 이러한 주형으로서 혈청 알부민 등. (33)의 전형적인 주형 단백질 합성 금 나노 결정은, 금 염 일정량 제 단백질 안에 캡슐화되고이어서 단백질 자체에 의해 감소된다. 단백질의 환원 능력은 알칼리성 용액의 pH를 증가시킴으로써 활성화 될 수있는 기능성의 아미노산 잔기 (예를 들어, 티로신) 성분에 기인한다. 단백질 구조의 전개는 금 나노 결정의 형성을위한 중요한 단계로 고려된다. 전개 된 단백질, 더 환원 관능기 캡슐화 금 염에 노출 될 수 있기 때문이다. 단백질 변성제에 열처리 또는 노광에 의해 달성 될 수 흘러 가고. 작은 분자 약물의 도입은 또한 중간 변성 온도 및 전개의 엔탈피를 수정 즉 전개 과정에 영향을 미칠 수있다. (34, 35) 이러한 모든 요인의 효과를 차례로 형광 금 나노 결정의 형성 반응 속도에 의해 반사 될 수 있으며 각성 얻어진 금 나노 결정의 형광 강도. 36
e_content는 ">이 비디오는 높은 온도 (60 ℃)에서 약물 – 로딩 알부민 단백질의 Au 나노 결정을 합성 또는 변성제 (예를 들면, 우레아) 얻어진 금 나노 결정의. 형광 강도의 존재 하에서 약물의 스크리닝 방법을 보여 신호 판독이다. 먼저, 금 나노가 금 나노. 초의 형성 반응 속도에 영향을 미치는 단백질 (열처리 또는 변성제에 의해 유도) 흘러 가고 방법을 보여 60 ℃에서 또는 우레아의 존재하에 처리 된 HSA 및 BSA 템플릿에서 합성되어, 금 나노 결정은 다른 약제와 함께 미리로드 단백질 템플릿을 합성하고, 얻어진 금 나노 결정의 상대적 형광 농도의 약물 로딩 효과는 상대적인 결합 강도의 측정을 제공하는 연구된다. 마지막으로, Au로 NC 약물 선별 프로토콜을 위해 수정 될 고정 된 농도의 단백질에 사전로드 약물 함량을 변화시킴으로써 약물 – 단백질 결합 상수 (K D)의 정량적 측정.Protocol
Representative Results
Discussion
이 방법으로 강조 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 다른 작은 분자 약물의 상대적 결합 친 화성을 심사의 프로토콜이 단계에서 3.1.2, 3.1.3 및 3.1.4은 상대 바인딩 강도 일관된 추세를 보여주는 좋은 결과를 얻을 중요하다. 이 단계에서, 측정 용 반응 액을 화학 물질을 첨가하여 드로잉 작업은 시간 지연 효과 및 일관성을 보장하기 위해 실시한다 측정 반응 액을 화학 물질을 첨가 및 도면의 동일?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Y.N.T. would like to acknowledge the Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore for the financial support under the JCO CDA grant 13302FG063.
Materials
| Gold (III) chloride solution, 30% | Sigma-Aldrich | 484385 | Corrosive, irritant |
| Human serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A1887 | |
| Bovine Serum albumin, 96% | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Ibuprofen, 98% | Sigma-Aldrich | I4883 | |
| warfarin, 98% | Sigma-Aldrich | A2250 | |
| phenytoin | Sigma-Aldrich | PHR1139 | |
| sulphanilamide, 99% | Sigma-Aldrich | S9251 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| urea | Sigma-Aldrich | U5128 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RT5 | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 | |
| 384-well plate | Corning | ||
| 5 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 1000 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 100 mL air displacement pipette | Eppendorf | ||
| 5000 mL Eppendorf tips | |||
| 1000 mL Eppendorf tips | |||
| 100 mL Eppendorf tips | |||
| 1.5 mL micro tube | Eppendorf | ||
| 20 mL glass vial with screw cap | |||
| 4 mL glass vial with screw cap |
Riferimenti
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