Präzise und Phenol Freie DNA Geschlechtsbestimmung von Tag 30 Schweineembryonen mittels PCR

Summary

This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.

Abstract

Die Erforschung pränatale Programmierung in das Schwein hat gezeigt, dass das Geschlecht des sich entwickelnden Embryo oder Fötus das Entwicklungsergebnis beeinflussen können. Daher ist die Fähigkeit, ein Embryo, das Geschlecht zu bestimmen, ist notwendig, viele Experimente besonders früh Entwicklung. Dieses Protokoll zeigt, eine kostengünstige, schnelle und nicht-toxische Herstellung von Schweine genomische DNA zur Verwendung mit PCR. Tag 30 Embryonen auf humane Weise den Richtlinien festgelegt nach durch Institutional Animal Politik und Wohlfahrtsausschüsse für das vorliegende Protokoll gesammelt werden müssen. Die Herstellung des gesamten Embryos für diese PCR basiert sexing Technik einfach beinhaltet die gefrorenen Embryos zu einem feinen Pulver Mahlen eines vorgekühlten Mörser und Pistill. PCR-Qualität-DNA wird aus einer kleinen Menge von Embryo Pulver freigesetzt durch eine heiße Inkubation in einem alkalischen Lyse-Reagenz aufgebracht wird. Als nächstes wird die DNA-Lösung mit Neutralisationspuffer gemischt und direkt für die PCR verwendet. Zwei Primerpaare erzeugt UVEKt bestimmte Geschlechtsbestimmungsbereich des Y-Chromosoms (SRY) und ZFX Bereich des X- Chromosoms mit hoher Genauigkeit und Spezifität. Das gleiche Protokoll kann auf andere längliche Embryonen (Tag 10 bis Tag 14) früher als Tag angewendet werden 30. Auch kann dieses Protokoll mit 96 quoll Platten durchgeführt werden, wenn eine große Anzahl von Embryos Screening, so dass es möglich für die Automation und Hoch Durchsatz Sex Typisierung.

Introduction

Das Hausschwein hat sowohl eine grundlegende Forschungsgegenstand in der Entwicklung, Genetik und Ernährung in den Bereichen Mensch und Vieh werden. Das Potential von Schweinen als biomedizinische Modelle für die Forschung mit menschlichen können, um ihre physiologischen Ähnlichkeiten zurückgeführt werden. In Nutztiere, kann die Manipulation von Geschlechterverhältnis, die Wirksamkeit der Selektion und Zuchtprogramme ¹ erhöhen. Sexing einzelnen Embryonen ist ein grundlegendes Werkzeug in vielen experimentellen Untersuchungen verwendet, einschließlich, jedoch nicht zu Genotyp, Epigenetik und X-Inaktivierung von Geschlechtsunterschied in der frühen Embryonalentwicklung ² beschränkt.

Studien an Mäusen legen nahe, dass mütterliche Ernährung und andere Faktoren in Geschlechterungleichgewicht ³ führen kann. Bei Schweinen Ursachen des Ungleichgewichts Geschlechterverhältnis sind väterlichen Zucht ^4, Gebärmutter-Kapazität ^5, und die Stoffwechsellage der Sau ^6. Da die beobachteten Unterschiede in Embryonen und Würfe können durch an sich beeinflusst werdenxual Dimorphismus, sollten Forscher bewusst Embryo Sex und Geschlechterverhältnisse, bevor Rückschlüsse auf ihre Forschung zu ziehen. Die Entwicklung von leistungsfähigen Werkzeugen und Protokollen für die Geschlechtsbestimmung Schwein Embryonen an Tag 30 der Entwicklung werden hier diskutiert.

Verschiedene Methoden der Geschlechtstypisierung wurden für genetische Studien in Modellorganismen und Viehzucht entwickelt. Besonders in der Tierhaltung, frühen Embryonen männliche und weibliche Identifizierung ist eine sehr gängige Praxis genetische Selektion für Zuchtprogramme zu verbessern. Am frühen Embryonen in der Schweine Karyotypisierung mit Giemsa ^{7 oder} die intensive Fluoreszenz ^8,9 Techniken wurden für Sex Typisierung verwendet. Jedoch sind diese Verfahren zeitaufwendig und eignet sich nicht für das Screening einer großen Anzahl von Embryonen schnell und genau.

Die effektivste Methode ist, sex Typisierung DNA-Amplifikation eine hitzestabile DNA-Polymerase und zwei Primern. DNA-Geschlechtsbestimmung durch PCR-Methode ist präziser, schneller und empfindlicher, our erfordert eine winzige Menge von Schaumstoffen. Die erste PCR-basierte Embryo Geschlechtsbestimmung ^{wurde am 10.} Menschen durchgeführt und später in Mäusen ^11, Rinder ^12, Büffel, Schafe ^{13 14} pre-Implantation-Embryonen. Beim Schwein wurde der früheste DNA Sex Typisierungsmethode für Präimplantationsembryonen etabliert über ein einziges Paar von Y-Chromosom-spezifischen DNA-Primer ^15. Jedoch waren die häufigsten PCR-Primer für die Geschlechtsbestimmung von dem Y-Chromosom der männlichen spezifischen Gens SRY ¹⁶ ausgewählt, und der nicht-geschlechtsspezifischen diskriminierende Bereich einer Zinkfinger-Gen an beiden X und Y-Chromosom ¹⁷ befindet. Anschließend wurden diese Primer wurden in dieser Studie mit verbesserter Spezifität der Primer zu erfassen nur die X- Chromosom eines Zinkfinger-Gen, das Geschlecht Tag 30-Embryonen zu bestimmen aufgetragen.

Genomische DNA aus Schweine Präimplantationsembryonen kann durch Belichten eines intakten Blastozyste mit proteinas zum Puffern extrahiert werdene ^{K 16} oder durch eine Biopsie von wenigen Zellen aus den einzelnen frühen Spaltung unter Embryonen ¹⁵ und für direkte PCR. Jedoch Freisetzung von DNA aus Schweineblut, Haare, Gewebe oder einem großen conceptus über einige Zentimeter groß ist nicht effektiv getan, um die Proteinase K-Methode. DNA-Extraktionsverfahren für diese Materialien wurden ¹⁸ entweder zeitaufwendig Phenol / Chloroform-Protokolle ^{6 oder} teuer Spalte basiert Kits hergestellt. Um die Verwendung von potentiell toxischen Chemikalien zu vermeiden, gibt es einen Trend kostengünstig, einfach und phenolfrei DNA Extraktionsverfahren zu entwickeln. Diese Art von Protokoll für die Isolierung von PCR-Qualität genomische DNA von der Maus ^{19 und} Zebrafisch ²⁰ Geweben wurde unter Verwendung von heißem Natriumhydroxid und Tris (HOTSHOT) etabliert. Diese Studie liefert ein Protokoll DNA mit modifizierten Hotshot und neu gestaltet Duplex Primerpaare für die PCR-Sex Eingabe direkt aus Zelllysaten von Tag 30 Schweineembryonen zu erhalten mithohe Genauigkeit.

Protocol

In Übereinstimmung mit dem Canadian Council on Animal Care-Richtlinien und mit Zustimmung der Fakultät Tierpolitik und Wohlfahrtsausschuss – Viehzucht von der University of Alberta, wurden trächtige Sauen durch geschultes Personal bei ungefähr Tag eingeschläfert 30 der Schwangerschaft und Embryonen wurden gesammelt. Verwenden Untersuchungshandschuhen jederzeit im Verlauf der Verfahren. 1. Probenentnahme und Probenlagerung Euthanize Sau mit durch Ausbluten gefolgt Bolzen. Tragen Untersuchungshands…

Representative Results

Ein repräsentatives Ergebnis der Geschlechtsbestimmung von 345 DNA Lysaten Screening mittels PCR ist in Abbildung 7 und zusammengefasst in Tabelle 1 dargestellt. Wie bei 65 ° C in Figur 7 ist der Primer Glühtemperatur sehen ist, ist die optimale Bedingung in diesem PCR-Protokoll ähnliche Intensität und prädizierten Amplikongrößen erzeugen (Figur 5) zwi…

Discussion

Die meisten der bestehenden Protokolle im Zusammenhang mit Schweineembryonen DNA Sex Typisierung sind nur für den frühen Stadium vor der Implantation Stufe ^15,16. Wir haben erfolgreich ein Protokoll für Schweineembryos Screening während der späten Schwangerschaft entwickelt. Basierend auf Studien mit ähnlichen Entwicklungsstadien von Embryonen aus früheren Studien ^6,18 ist die vorliegende Protokoll als sicherer und kostengünstig zu sein.

Dieses Protokoll ist fü…

Materials

KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit	KAPABiosystems	KR0370	other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization
SYBR Safe DNA Gel Stain	Life Technologies	S33102	Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe
Pig female and male genomic DNA	Zyagen	GP-160-F1 & GP-160-M5	Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used.
Typhoon FLA 9500 laser scanner	GE Healthcare Life Sciences	28-9969-43	other imaging system can be used
Free Soft Nitrile Examination Gloves	WWR	89038-270	any other examination glove can be used
Sodium hydroxide, solid	Fisher	BP 359 -212	Molecular Biology Grade
Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean	Eppendorff	0030 108.051	heat resistant
ThermoStat plus	Eppendorff	22670204	Use as a incubator for 95C, don't need to use the heater
Toothpick	Bunzl Plc	75200815	Any round wooden toothpicks can be used – quality wood
Microcentrifuge 5417R/5417C	Eppendorff	22621807	This model was discontinued. But another newer model can be used
Microspatula	Fisher	SDI28540115	Autoclaved before use each time.