Точная и фенола свободной ДНК Sexing дня 30 свиней эмбрионов с помощью ПЦР

Summary

This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.

Abstract

Исследование пренатального программирования в свинье показало, что пол развивающегося эмбриона или плода могут влиять на процесс развития. Таким образом, способность определять пол эмбриона является необходимым во многих экспериментах, особенно в отношении раннего развития. Настоящий Протокол демонстрирует недорогой, быстрый и нетоксичный препарат геномной ДНК свиньи для использования с PCR. День 30 эмбрионов должны быть гуманно собраны в соответствии с руководящими принципами, установленными институциональной политики животных и комитетов благосостояния для настоящего протокола. Получение всей эмбриона для этого основанного ПЦР методики Sexing просто включает измельчения замороженного эмбриона до тонкого порошка с использованием предварительно охлажденного ступку и пестик. ПЦР-качество ДНК высвобождается из небольшого количества эмбрионов порошка путем подачи горячей инкубацию в щелочным реагентом для лизиса. Далее, ДНК-раствор смешивают с нейтрализации буфера и использовали непосредственно для ПЦР. Два пары праймеров генерируются в DETECт удельная секс определении области хромосомы Y- (SRY) и ZFX области хромосомы X- с высокой точностью и специфичностью. Же протокол может быть применен к другим удлиненных эмбрионов (день 10 до 14-й день) раньше, чем День 30. Также, этот протокол может быть осуществлена ​​с 96-разгораются пластин при скрининге большого количества зародышей, что делает его возможным для автоматизации и высокой пропускная секс печатать.

Introduction

Домашняя свинья стала фундаментальной предметом исследования в развитии, генетики и питания в обоих человека и животноводческих отраслей. Потенциал свиней в качестве биомедицинских моделей для человеческого исследования можно отнести к их физиологических сходств. В животноводстве, манипулирование соотношение полов может повысить эффективность отбора и генетического улучшения ^{программ 1.} Sexing отдельные эмбрионов является фундаментальным инструментом, используемым во многих экспериментальных исследований, включая, но не ограничиваясь генотипа, эпигенетике и X инактивации половой диморфизм во время раннего развития эмбриона ^2.

Исследования на мышах показывают, что материнская диета и другие факторы могут привести к половым дисбалансом ^3. У свиней, причины соотношение полов дисбаланс включают отцовской породы ^4, емкость матки ^5, и метаболический состояние свиноматки ^6. Поскольку различия, наблюдаемые у эмбрионов и пометов могут влиять SEальными диморфизм, исследователи должны быть осведомлены о эмбриона пола и соотношения полов, прежде чем делать выводы относительно их исследований. Развитие эффективных инструментов и протоколов для определения пола эмбрионов свиньи на 30 день развития будут обсуждаться здесь.

Различные методы полового печатать были разработаны для генетических исследований в модельных организмов и скота. В частности, в скота, выявлении мужского и женского ранних эмбрионов является очень распространенной практикой для повышения генетического отбора для селекционных программах. Ранние эмбрионы кариотипирование в свинью использованием Гимза ⁷ или интенсивную флуоресценцию ^8,9 методы были использованы для секса печатать. Тем не менее, эти методы являются трудоемким и не подходит для скрининга большого числа зародышей быстро и точно.

Наиболее эффективный метод пола набрав амплификации ДНК с использованием термостабильной ДНК-полимеразы и пары праймеров. определение пола ДНК методом ПЦР является более конкретным, быстрый и чувствительный, оолько требующих незначительное количество клеточных материалов. Первой ПЦР на основе эмбриона определение пола была выполнена на людях ^10, а позже у мышей ^11, крупного рогатого скота ^12, буйволы ¹³ и овец ¹⁴ предимплантационной эмбрионов. В свиньи, самый ранний ДНК секс метод набрав был создан для преимплантационных эмбрионов с помощью одной пары Y-хромосомы праймеров, специфичных ДНК ^15. Тем не менее, наиболее распространенные ПЦР-праймеры для определения пола были отобраны из Y-хромосомы у мужчин специфического гена SRY ¹⁶ и без секса дискриминационного области гена цинка пальца, расположенного по адресу Х и Y ^{хромосомы 17.} Впоследствии эти праймеры были применены к определить пол День 30 эмбрионов в этом исследовании с улучшенной специфичностью праймеров для обнаружения только X- хромосому гена цинк-пальцем.

Геномную ДНК из свиных эмбрионов предимплантационной могут быть извлечены путем воздействия интактной бластоцисты в буфер с proteinas^ К ¹⁶ либо путем биопсии нескольких клеток от индивидуального начале расщепления эмбрионов ^{15 и} использовать их для прямого ПЦР. Тем не менее, выпуск ДНК из свиной крови, волос, тканей или большой зародыш в течение нескольких сантиметров в размере не эффективно осуществляется с помощью протеиназы метод K. Методы экстракции ДНК для этих материалов были созданы с использованием либо трудоемких фенол / хлороформ протоколы ^{6 или} основанные дорого колонка комплекты ^18. Во избежание использования потенциально токсичных химических веществ, наблюдается тенденция развивать недорогой, простой и фенолов в методы выделения ДНК. Этот тип протокола для выделения ПЦР-качества геномной ДНК из мышей ¹⁹ и данио ²⁰ тканей была создана с использованием горячего гидроксида натрия и трис (HotShot). Это исследование обеспечивает протокол для получения ДНК с модифицированными HotShot и переработан пары праймеров дуплекс для ПЦР пола набрав непосредственно из клеточных лизатов Дня 30 свиных эмбрионов свысокая точность.

Protocol

В соответствии с Канадским советом по принципов ухода за животными и с одобрения политики факультета животноводства и Комитета благосостояния – поголовье Университета Альберты, беременных свиноматок были умерщвлены по подготовленных штабами приблизительно 30 день беременности и эмбрионов были…

Representative Results

Представитель результат определения пола из 345 ДНК скрининга лизатов ПЦР показано на рисунке 7 и в таблице 1. Как можно видеть на фигуре 7, температура отжига праймеров при 65 ° С является оптимальной условием ?…

Discussion

Большинство существующих протоколов, связанных с свиного эмбрионы ДНК секс набрав пригодны только для ранней стадии предимплантационной стадии ^15,16. Мы успешно разработали протокол, подходящий для свиней скрининга эмбрионов в конце беременности. Основываясь на исследованиях с ?…

Materials

KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit	KAPABiosystems	KR0370	other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization
SYBR Safe DNA Gel Stain	Life Technologies	S33102	Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe
Pig female and male genomic DNA	Zyagen	GP-160-F1 & GP-160-M5	Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used.
Typhoon FLA 9500 laser scanner	GE Healthcare Life Sciences	28-9969-43	other imaging system can be used
Free Soft Nitrile Examination Gloves	WWR	89038-270	any other examination glove can be used
Sodium hydroxide, solid	Fisher	BP 359 -212	Molecular Biology Grade
Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean	Eppendorff	0030 108.051	heat resistant
ThermoStat plus	Eppendorff	22670204	Use as a incubator for 95C, don't need to use the heater
Toothpick	Bunzl Plc	75200815	Any round wooden toothpicks can be used – quality wood
Microcentrifuge 5417R/5417C	Eppendorff	22621807	This model was discontinued. But another newer model can be used
Microspatula	Fisher	SDI28540115	Autoclaved before use each time.