دقيقة والفينول الحرة الحمض النووي مبالغات من يوم 30 خنزيري الأجنة بواسطة PCR
Summary
This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.
Abstract
وقد أظهرت الأبحاث في البرمجة قبل الولادة في خنزير أن جنس الجنين أو الجنين يمكن أن تؤثر على نتائج تنموية. ولذلك، فإن القدرة على تحديد جنس الجنين هي ضرورية في العديد من التجارب وخاصة فيما يتعلق بالتنمية في وقت مبكر. يوضح هذا البروتوكول على إعداد وغير مكلفة وسريعة وغير سامة من خنزير الحمض النووي الجيني للاستخدام مع PCR. يوم 30 الأجنة يجب جمعت إنسانية وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها سياسة الحيوان المؤسسي ولجان الرعاية لهذا البروتوكول. إعداد جنين كامل لهذه التقنية [سإكسينغ PCR القائم ينطوي ببساطة طحن الجنين المجمد إلى مسحوق ناعم باستخدام هاون قبل المبردة ومدقة. يتم تحريرها DNA PCR الجودة من كمية صغيرة من مسحوق الجنين عن طريق تطبيق حضانة الساخنة في كاشف تحلل القلوية. بعد ذلك، يتم خلط محلول الحمض النووي مع العازلة تحييد وتستخدم مباشرة لPCR. يتم إنشاء اثنين من أزواج التمهيدي لDETECر الجنس محدد تحديد المنطقة من كروموسوم Y- (SRY) والمنطقة ZFX من كروموسوم X- مع دقة عالية وخصوصية. ويمكن تطبيق البروتوكول نفسه إلى الأجنة ممدود الأخرى (يوم 10 إلى يوم 14) في وقت سابق من يوم 30. أيضا، يمكن أن يتم هذا البروتوكول مع لوحات 96 حفر آبار-عند فحص عدد كبير من الأجنة، مما يجعل من الممكن لأتمتة وعالية سرعة الكتابة الجنس.
Introduction
أصبح الخنزير المحلي على البحوث الأساسية موضوع في التنمية، وعلم الوراثة والتغذية في القطاعين الإنسان والماشية. إمكانات الخنازير كنماذج الطبية للبحوث البشري يمكن أن يعزى إلى أوجه الشبه بينهما الفسيولوجية. في الثروة الحيوانية، ويمكن التلاعب في نسبة الجنس تعزيز فعالية اختيار والتحسين الوراثي برامج 1. مبالغات الأجنة الفردية هو أداة أساسية تستخدم في العديد من التحقيقات التجريبية بما في ذلك ولكن لا تقتصر على النمط الجيني، التخلق وتعطيل الصبغي X من إزدواج الشكل الجنسي أثناء تطور الجنين في وقت مبكر 2.
الدراسات على الفئران تشير إلى أن النظام الغذائي للأم وعوامل أخرى قد يؤدي إلى اختلال التوازن بين الجنسين 3. في الخنازير، أسباب الجنس نسبة الخلل تشمل سلالة الأب 4، قدرة الرحم 5، وحالة زرع الأيضية 6. منذ الاختلافات التي لوحظت في الأجنة والفضلات يمكن أن تتأثر حد ذاتهاxual إزدواج الشكل، يجب أن يكون الباحثون على علم الجنس الجنين ونسب الجنس قبل التوصل إلى استنتاجات بشأن أبحاثهم. تطوير أدوات وبروتوكولات فعالة لمبالغات أجنة الخنازير في يوم 30 من التطوير سوف تتم مناقشتها هنا.
وقد وضعت أساليب مختلفة من الكتابة الجنس للدراسات الجينية في الكائنات نموذج والثروة الحيوانية. ولا سيما في مجال الثروة الحيوانية، وتحديد الأجنة في وقت مبكر من الذكور والإناث هو ممارسة شائعة جدا لتعزيز الانتقاء الجيني لبرامج التربية. وقد استخدمت الأجنة المبكرة تنميط نووي في خنزير باستخدام بالغيمزا 7 أو مضان مكثفة 8،9 تقنيات الكتابة الجنس. ومع ذلك، وهذه الأساليب هي مضيعة للوقت وغير مناسبة لفحص أعداد كبيرة من الأجنة بسرعة وبدقة.
الأسلوب الأكثر فعالية الجنس في الكتابة هو تضخيم الحمض النووي باستخدام الحرارة مستقرة البلمرة DNA وزوج من الاشعال. [سإكسينغ الحمض النووي بطريقة PCR هو أكثر تحديدا، أسرع وأكثر دقة، ستتطلب نلي كمية ضئيلة من المواد الخلوية. تم إجراء أول سإكسينغ] الجنين PCR القائم على البشر 10، وبعد ذلك في الفئران 11، الأنعام 12، والجاموس والغنم 13 14 الأجنة ما قبل الزرع. في الخنزير، وقد تم تأسيسها في أقرب الجنس DNA طريقة الكتابة للأجنة ما قبل الزرع عبر زوج واحد من كروموسوم الاشعال DNA محددة 15. ومع ذلك، تم اختيار الاشعال PCR الأكثر شيوعا لتحديد الجنس من Y كروموسوم من الذكور محدد SRY الجين 16 وعدم الجنس المنطقة التمييزية من الجين الزنك الاصبع الموجود في كل من X و Y كروموسوم 17. وفي وقت لاحق، وقد تم تطبيق هذه الاشعال لتحديد جنس يوم 30 الأجنة في هذه الدراسة مع تحسين خصوصية الاشعال للكشف فقط كروموسوم X- من الجين الزنك الاصبع.
الحمض النووي الجيني من الأجنة ما قبل الزرع الخنازير يمكن استخلاصها من خلال تعريض أحد الكيسة سليمة لالعازلة مع proteinasه ك 16 أو عن طريق أخذ خزعة من عدد قليل من الخلايا من الانقسام في وقت مبكر الفردية الأجنة 15 واستخدامها لPCR المباشر. ومع ذلك، لم تفعل الإفراج عن الحمض النووي من دم الخنزير، الشعر، الأنسجة أو الحمل المستكن كبير على مدى بضعة سنتيمترات في الحجم على نحو فعال باستخدام بروتين طريقة K. تم إنشاء طرق استخلاص الحمض النووي لهذه المواد باستخدام إما تستغرق وقتا طويلا بروتوكولات الفينول / الكلوروفورم 6 أو مجموعات العمود مكلفة أساس 18. من أجل تجنب استخدام المواد الكيميائية السامة، هناك اتجاه لتطوير غير مكلفة، وطرق استخراج الحمض النووي سهلة وخالية من الفينول. تم تأسيس هذا النوع من بروتوكول لعزل PCR ذات جودة الحمض النووي الجيني من الماوس 19 و الزرد 20 الأنسجة باستخدام هيدروكسيد الصوديوم الساخن وتريس (البارع). وتقدم هذه الدراسة على بروتوكول للحصول على الحمض النووي مع تعديل البارع وإعادة تصميم أزواج التمهيدي دوبلكس للPCR الجنس كتابة مباشرة من الخلية لست] من يوم 30 الأجنة الخنزير معدقة عالية.
Protocol
Representative Results
Discussion
معظم البروتوكولات القائمة المتصلة الخنازير الأجنة الحمض النووي الجنس في الكتابة هي مناسبة فقط للمرحلة الأولى مرحلة ما قبل الزرع 15،16. لقد نجحت في تطوير بروتوكول مناسبة لفحص الجنين الخنازير في أواخر الحمل. استنادا إلى دراسات مع مراحل نمو مماثلة من الأجنة من الد?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أن نعترف التعاون والمساهمات المالية من وكالة تمويل البحوث التالية: ألبرتا الثروة الحيوانية واللحوم وكالة المحدودة، CRC لحم الخنزير، ألبرتا لحم الخنزير، Hypor شركة هندريكس علم الوراثة وNSERC CRSNG.
Materials
| KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit | KAPABiosystems | KR0370 | other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Life Technologies | S33102 | Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe |
| Pig female and male genomic DNA | Zyagen | GP-160-F1 & GP-160-M5 | Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used. |
| Typhoon FLA 9500 laser scanner | GE Healthcare Life Sciences | 28-9969-43 | other imaging system can be used |
| Free Soft Nitrile Examination Gloves | WWR | 89038-270 | any other examination glove can be used |
| Sodium hydroxide, solid | Fisher | BP 359 -212 | Molecular Biology Grade |
| Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean | Eppendorff | 0030 108.051 | heat resistant |
| ThermoStat plus | Eppendorff | 22670204 | Use as a incubator for 95C, don't need to use the heater |
| Toothpick | Bunzl Plc | 75200815 | Any round wooden toothpicks can be used – quality wood |
| Microcentrifuge 5417R/5417C | Eppendorff | 22621807 | This model was discontinued. But another newer model can be used |
| Microspatula | Fisher | SDI28540115 | Autoclaved before use each time. |
Riferimenti
- Seidel, G. E. Economics of selecting for sex: the most important genetic trait. Theriogenology. 59, 585-598 (2003).
- Gutiérrez-Adán, A., et al. Development consequences of sexual dimorphism during pre-implantation embryonic development. Reprod. Domest. Anim. 41, 54-62 (2006).
- Rosenfeld, C. S., Roberts, R. M. Maternal diet and other factors affecting offspring sex ratio: a review. Biol Reprod. 71, 1063-1070 (2004).
- Gorecki, M. T. Sex ratio in litters of domestic pigs (Sus scrofa f. domestica Linnaeus, 1758). Biol. Lett. 40, 111-118 (2003).
- Chen, Z. Y., Dziuk, P. J. Influence of initial length of uterus per embryo and gestation stage on prenatal survival, development, and sex ratio in the pig. J. Anim. Sci. 71, 1895-1901 (1993).
- Vinsky, M. D., Novak, S., Dixon, W. T., Dyck, M. K., Foxcroft, G. R. Nutritional restriction in lactating primiparous sows selectively affects female embryo survival and overall litter. Reprod. Fertil. Dev. 18, 347-355 (2006).
- Cassar, G., King, W. A., King, G. J. Influence of sex on early growth of pig conceptuses. J. Reprod. Fertil. 101, 317-320 (1994).
- Zudova, D., Rezacova, O., Kubickova, S., Rubes, J. Aneuploidy detection in porcine embryos using fluorescence in situ hybridization. Cytogenet Genome Res. 102, 179-183 (2003).
- Hornak, M., Oracova, E., Hulinska, P., Urbankova, L., Rubes, J. Aneuploidy detection in pigs using comparative genomic hybridization: from the oocytes to blastocysts. PLoS One. 7, (2012).
- Handyside, A. H., Pattinson, J. K., Penketh, R. J., Delhanty, J. D., Winston, R. M., Tuddenham, E. G. Biopsy of human preimplantation embryos and sexing by DNA amplification. Lancet. 1, 347-349 (1989).
- Wilton, L. J., Shaw, J. M., Trounson, A. O. Successful single-cell biopsy and cryopreservation of preimplantation mouse embryos. Feri. Steril. 51, 513-517 (1989).
- Peura, J. M., Turunen, M., Janne, J. A reliable sex determination assay for bovine preimplantation embryos using the polymerase chain reaction. Theriogenology. 35, 547-555 (1991).
- Rao, K. B., Pawshe, C. H., Totey, S. M. Sex determination of in vitro developed buffalo (Buhalus buhalis.) embryos by DNA amplification. Mol. Reprod. Dev. 36, 291-296 (1993).
- Herr, C. M., Matthaei, K. I., Petrzak, U., Reed, K. C. A rapid Y-chromosome-detecting ovine embryo sexing assay. Theriogenology. 33, 245 (1990).
- Fajfar-Whetstone, C. J., LaneRayburn, A., Schook, L. B., Wheeler, M. B. Sex determination of porcine during preimplantation embryos via y-chromosome specific DNA sequences. Animal Biotechnology. 4, 183-193 (1993).
- Pomp, D., Good, B. A., Geisert, R. D., Corbin, C. J., Conley, A. J. Sex identification in mammals with polymerase chain reaction and its use to examine sex effects on diameter of day-10 or -11 pig embryos. J. Anim. Sci. 73, 1408-1415 (1995).
- Aasen, E., Medrano, J. F. Amplification of the ZFY and ZFX genes for sex identification in humans, cattle, sheep and goats. Biotechnology (N Y). 8, 1279-1281 (1990).
- Oliver, G., et al. Restricted feed intake in lactating primiparous sows. II. Effects on subsequent litter sex ratio and embryonic gene expression. Reprod Fertil. Dev. 23, 899-911 (2011).
- Truett, G. E., Heeger, P., Mynatt, R. L., Truett, A. A., Walker, J. A., Warman, M. L. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT). Biotechniques. 29, 52-54 (2000).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish embryos. Biotechniques. 43, 610-614 (2007).
- Almeida, F. C. R. L., Machado, G. S., Borges, A. L. C. C., Rosa, B. O., Fontes, D. O. Consequences of different dietary energy sources during folliculardevelopment on subsequent fertility of cyclic gilts. Animal. 8, 293-299 (2014).
- Foxcroft, G. R., Dixon, W. T., Dyck, M. K., Novak, S., Harding, J. C. S., Almeida, F. C. R. L., Rodriguez-Martinez, Prenatal programming of postnatal development in the pig. Control of Pig Reproduction VIII. , 212-213 (2009).
