PCR에 의한 날 (30) 돼지 배아의 정확하고 페놀 무료 DNA Sexing

Summary

This protocol describes an accurate, inexpensive, rapid and non-toxic method to determine the sex of Day 30 porcine embryo using PCR method after grinding an embryo into powder without phenol chloroform extraction and DNA column purification.

Abstract

돼지의 태아 프로그래밍에 대한 연구는 배아 또는 태아의 성별이 발달 결과에 영향을 미칠 수있는 것으로 나타났습니다. 따라서, 배아의 성을 확인하는 능력은 특히 초기 개발에 대한 많은 실험이 필요하다. 본 프로토콜은 PCR에 사용할 돼지 게놈 DNA의 저렴하고 신속하고 비 독성 제제를 보여준다. 하루 30 배아는 인도적 본 프로토콜에 대한 기관 동물 정책 및 복지위원회가 설정 한 가이드 라인에 따라 수집해야합니다. 이 PCR 기반 sexing 기술에 대한 전체 배아의 제조는 단순히 미리 냉각 막자 사발을 사용하여 미세한 분말로 분쇄 냉동 배아를 포함한다. PCR 품질 DNA는 알칼리 용해 시약 뜨거운 인큐베이션함으로써 배아 분말 소량 방출된다. 그 다음, DNA 용액을 중화 완충액과 혼합하고 PCR에 직접 사용했다. 두 프라이머 쌍은 detec하기 위해 생성된다높은 정밀도와 특이 X- 염색체의 Y- 염색체 (SRY)와 ZFX 영역의 영역을 결정 t 특정 성. 동일한 프로토콜 일 이전 다른 신장 배아 (주 14 주 10)에 적용 할 수있다 (30)의 자동화 및 높은 것이 가능하게 배아 다수 선별 경우 이러한 프로토콜은 96 솟아 플레이트로 수행 될 수있다 처리량 섹스 입력합니다.

Introduction

돼지는 인간과 가축 부문 모두에서 개발, 유전학과 영양의 기초 연구 대상이되고있다. 인간에 ​​대한 생물 의학 연구 모델로 돼지의 전위 생리적 유사성에 기인 할 수있다. 가축, 성비의 조작 선택 유전자 개선 프로그램 ^(1)의 효과를 향상시킬 수있다. 개별 배아를 Sexing하는 것은 포함하지만 초기 배아 개발 ^2시 유전자형, 후성 유전학 성적 이형 태성의 X 불 활성화에 국한되지 많은 실험 연구에 사용되는 기본 도구입니다.

생쥐의 연구는 산모의식이 요법과 다른 요인은 성별 불균형 ³ 발생할 수 있습니다 것이 좋습니다. 돼지에서 성비 불균형의 원인은 아버지의 품종 ^4, 자궁 용량 ^5, 모돈의 대사 상태 ^(6)을 포함한다. 배아 및 새끼 관찰 차이 자체에 의해 영향을받을 수 있기 때문에xual의 이형 태성은, 연구자들은 자신의 연구에 대한 결론을 도출하기 전에 배아 섹스와 섹스 비율을 알고 있어야합니다. 개발의 날 (30)에 돼지 배아를 sexing을위한 효율적인 툴과 프로토콜의 개발은 여기에서 논의 될 것이다.

섹스 입력의 다양한 방법 모델 생물과 가축의 유전 연구를 위해 개발되었습니다. 특히 가축에, 남성과 여성의 초기 배아를 식별하는 육종 프로그램에 대한 유전 적 선택을 향상시키기 위해 매우 일반적이다. 김사 ⁷ 강렬한 형광 ^8,9 기술을 사용하여 돼지의 핵형 초기 배아는 성 입력을 위해 사용되어왔다. 그러나, 이들 방법은 시간 소모적이고 신속하고 정확하게 다수의 배아 스크리닝에 적합하지 않다.

가장 효과적인 성 입력 방법은 열 안정성 DNA 폴리머 라제 및 프라이머 쌍을 사용하여 DNA의 증폭이다. PCR 법에 의한 DNA의 sexing는 오보다, 특정 신속하고 민감할수 있답니다 다공질 재료의 미세한 양을 요구. 첫 번째 PCR 기반의 배아 sexing 인간 ^(10)에서 수행하고, 나중에 마우스 ^(11), 소 ^(12), 버팔로 ^(13)와 양 ⁽¹⁴⁾ 착상 전 배아에서했다. 돼지에서 초기 DNA 섹스 입력 방법은 Y 염색체 특이 DNA 프라이머 ^(15)의 한 쌍을 통해 착상 전 배아를 위해 설립되었다. 그러나 성 결정을위한 가장 일반적인 PCR 프라이머 말레 특정 SRY 유전자 ⁽¹⁶⁾ 및 X 및 Y 염색체 ¹⁷ 모두에 위치 징크 핑거 유전자의 비 성 차별적 영역의 Y 염색체로부터 선택 하였다. 이어서,이 프라이머는 아연 핑거 유전자의 X- 염색체를 검출하는 프라이머의 향상된 특이성이 연구에서 30 일 된 배아의 성을 확인하기 위해 적용되어왔다.

돼지의 착상 전 배아에서 게놈 DNA를 proteinas와 버퍼링 그대로 배반포를 노출하여 추출 할 수있다전자 K ⁽¹⁶⁾ 또는 개별 초기 분열에서 몇 세포의 생검을 고려하여 ^{15 배아} 직접 PCR을 위해 그들을 사용. 그러나 돼지의 혈액, 머리카락, 조직 또는 크기가 몇 센티미터 이상의 큰 수태에서 DNA의 방출을 효과적으로 테 K 방법을 사용하여 수행되지 않습니다. 이들 물질에 대한 DNA 추출 방법은 시간이 많이 걸리고, 페놀 / 클로로포름 프로토콜 ⁶ 비싼 열 기반 키트 ^(18)를 사용하여 설정 하였다. 잠재적 독성 화학 물질의 사용을 피하기 위해, 저렴하고 쉬운 페놀없는 DNA 추출 방법을 개발하는 경향이있다. 마우스 ⁽¹⁹⁾ 및 ⁽²⁰⁾ 지브라 피쉬 조직으로부터 PCR 품질 게놈 DNA의 분리를위한 프로토콜이 이러한 유형의 핫 수산화 나트륨 및 트리스 (유능한)를 사용하여 구축되었다. 이 연구는 PCR 섹스인가요 수정 및 재 설계 이중 프라이머 쌍은 일의 세포 용 해물 (30) 돼지 배아에 직접 입력하여 DNA를 얻을 수있는 프로토콜을 제공높은 정확도.

Protocol

동물 관리 지침에 캐나다 협의회와 학부 동물 정책 복지위원회의 승인에 따라 – 알버타 대학의 가축, 임신 모돈은 임신과 태아의 (30)는 수집 된 약의 날 훈련 된 직원에 의해 안락사시켰다. 과정에서 항상 시험 장갑을 사용합니다. 1. 샘플 수집 및 샘플 보관 방혈 다음 고정 볼트를 사용하여 모돈을 안락사. 각 안락사 모돈에서 생식 책자와 배아를 수집하기 위해 시험 장갑을 착용 할 ?…

Representative Results

PCR에 의한 DNA 345 스크리닝 용 해물로부터 성 결정의 대표적인 결과가도 7에 도시되고 표 1에 요약 하였다. 도 7에서 알 수있는 바와 같이, 65 ℃에서 프라이머의 어닐링 온도가 다른 시료 중이 PCR 프로토콜에 유사한 강도와 프리디 케이드 앰플 리콘 크기를 생성 (도 5)의 최적의…

Discussion

돼지 배아의 DNA 섹스 입력과 관련된 기존 프로토콜의 대부분은 초기 착상 전 단계 ^{(15, 16)에만} 적합하다. 우리는 성공적으로 임신 후기 돼지 배아 선별에 적합한 프로토콜을 개발했습니다. 이전 연구 ^6,18 배아의 발달 단계와 유사한 연구에 근거하여, 본 프로토콜은 안전하고 저비용으로되는 것으로 간주된다.

이 프로토콜은 또한 96- 웰 플레이트에 DNA 해물로 ?…

Materials

KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit	KAPABiosystems	KR0370	other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization
SYBR Safe DNA Gel Stain	Life Technologies	S33102	Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe
Pig female and male genomic DNA	Zyagen	GP-160-F1 & GP-160-M5	Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used.
Typhoon FLA 9500 laser scanner	GE Healthcare Life Sciences	28-9969-43	other imaging system can be used
Free Soft Nitrile Examination Gloves	WWR	89038-270	any other examination glove can be used
Sodium hydroxide, solid	Fisher	BP 359 -212	Molecular Biology Grade
Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean	Eppendorff	0030 108.051	heat resistant
ThermoStat plus	Eppendorff	22670204	Use as a incubator for 95C, don't need to use the heater
Toothpick	Bunzl Plc	75200815	Any round wooden toothpicks can be used – quality wood
Microcentrifuge 5417R/5417C	Eppendorff	22621807	This model was discontinued. But another newer model can be used
Microspatula	Fisher	SDI28540115	Autoclaved before use each time.