חלופה פשוטה להזרקת stereotactic למציאה ספציפית המוח של מירנה
Summary
MicroRNAs play crucial roles in the brain and are potential targets for modeling neuro-degeneration. However, perturbing miRNA levels is challenging due to the short length of miRNA and inaccessibility of the brain tissue. This video presents a method for antagomir design and brain specific delivery using a neuropeptide in mice.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression. In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the correct expression of microRNAs. Perturbation of microRNAs in the brain can be used to model neurodegenerative diseases by modulating neuronal cell death. Currently, stereotactic injection is used to deliver miRNA knockdown agents to specific location in the brain. Here, we discuss strategies to design antagomirs against miRNA with locked nucleotide modifications (LNA). Subsequently describe a method for brain specific delivery of antagomirs, uniformly across different regions of the brain. This method is simple and widely applicable since it overcomes the surgery, associated injury and limitation of local delivery in stereotactic injections. We prepared a complex of neurotropic, cell-penetrating peptide Rabies Virus Glycoprotein (RVG) with antagomir against miRNA-29 and injected through tail vein, to specifically deliver in the brain. The antagomir design incorporated features that allow specific targeting of the miRNA and formation of non-covalent complexes with the peptide. The knock-down of the miRNA in neuronal cells, resulted in apoptotic cell death and associated behavioural defects. Thus, the method can be used for acute models of neuro-degeneration through the perturbation of miRNAs.
Introduction
מיקרו RNA צמחו כמטרות טיפוליות חדשניות בשל תפקידם האוניברסלי בוויסות של ביטוי גנים וראיה ישירה למעורבות במחלה. MiRNAs הם נבדקות באופן פעיל לפוטנציאל שלהם כתרופת מטרות 1,2. יתר על כן, שינויים בביטוי מירנה קשורים עם כמה מחלות 3 וסימולציה של שינויים אלה על ידי ההפרעות מלאכותיות של ביטוי מירנה ניתן להשתמש כדי ללמוד את מסלולי הסלולר מעורבים בביטוי מחלה. משלוח רקמות ספציפי של תרופות המכוונות למירנה הוא כיום אתגר גדול לפיתוח תרופות המבוסס מירנה. Antagomirs ומחקה מירנה סוכנים מבטיחים לperturbing רמות מירנה 4-6. עם זאת, תכונות מיוחדות המשפרות את הספציפיות והיעילות שלהם צריכה להיות משולבות בעיצוב של antagomirs לפני שהם יכולים לשמש להפרעות בvivo של ביטוי מירנה.
מיקרו RNA רלוונטי במיוחד כמטרות בניווניות חשוכות מרפא כיום ומחלות נוירו-התפתחותית. מחסום דם-המוח מהווה מגבלה למסירת antagomirs במוח. זריקות stereotactic נמצאות בשימוש נרחבת במודלים של מכרסמים לספק מולקולות למקומות ספציפיים במוח 7. זה דורש מיומנות, השקעה נרחבת במכשור וזמן. זריקות stereotactic הן פולשני, כוללים ניתוח, לגרום לקטין לפחות פציעה ומוגבלת לאספקה מקומית. השימוש בפפטידים תא חודר עם העדפה לנוירונים מיקוד יכול להתמודד מגבלות אלה שכן הם יכולים להיות מועברים באמצעות מסלול טרנס וכלי דם, אך לפרוץ את מחסום דם המוח. כגון פפטיד נגזר מוירוס הכלבת גליקופרוטאין (RVG), שימש בעבר כדי לספק siRNA כנגד וירוס דלקת מוח יפני בעכברים 8. מצאנו כי השימוש בפפטיד לantagomir משלוח, miRNAs יכול להיות יעיל הפיל במוח העכבר 9.
ontent "> האתגר הגדול השני של מירנה לדפוק למטה נובע מגודלו הקטן של miRNAs ואת הנוכחות של isoforms רצף קשור באופן הדוק. אנחנו לוקחים את הדוגמא של MMU-miR-29 משפחה שמורכבת משלושה isoforms קשור באופן הדוק, miR-29 , B ו- C. Antagomirs גם בדרך כלל שונה לאורך עמוד השדרה כדי להגדיל את היציבות שלהם והופך אותם עמידים להתקפות של nucleases. נעול חומצות גרעין (LNAs) מציעות יתרון נוסף שהם משפרים יציבות תרמית ואף להוביל ליעד השפלה מעל ומעבר הפרעה סטרית 10. היכרות עם שינויים לכל אורך עמוד השדרה יכולה להיות יעילה אך יקר. יש לנו קודם לכן ראו ששינויים מעבר למספר אופטימלי עשויים שלא לשפר את היעילות נוספת. העיצוב של antagomir לכן כרוך השינוי האופטימלי של antagomir.למורכב antagomir לא קוולנטית עם פפטיד neurotropic, יחויב hepta- להארכה נונה-ארגינין משמשת. D-ארגיניןשאריות משמשות מאז שהם מעניקים יציבות גבוהה יותר כפי שהם לא רגישים למחשוף על ידי פרוטאזות. Hepta- למתיחות נונה-ארגינין לפעול סוכני תא חודר יעילים כ, למרות שהם אינם מקנים סגוליות סוג התא. על ידי קוולנטית קישור פפטיד RVG למקשר נונה-ארגינין, neurotropic, פפטיד תא חודר נוצר. שאריות מטען החשמליות חיובי של פפטיד אינטראקציה עם עמוד השדרה חומצות גרעין הטעון השלילי, ליצירת קומפלקסים. מתחמים אלה יכולים לשמש לtransfect יעילות DNA או RNA לתאים בתרבית וin vivo לרקמות.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here we demonstrate a widely accessible methodology to study the effects of miRNA modulation. Currently, most attempts at in vivo characterization of miRNA functions involve the creation of knockout mice or a transgenic that expresses a miRNA sponge. Most miRNAs, even the cell type specific ones are expressed in more than one organ. For instance, miRNAs initially thought to be specific to the hematopoietic system are also expressed in the brain, due to the presence of microglia. Thus even a cell type specifi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Souvik Maiti for help in designing the antagomirs. We also acknowledge Rangeetha J. Naik, Rakesh Dey, and Bijay Pattnaik for their help with experimental methods. This work was funded by the Council of Scientific and Industrial Research (BSC0123). HS, MV and RR acknowledge fellowship from the Council of Scientific and Industrial Research, India. MAS acknowledge fellowship from the University Grants Commission, India.
Materials
| Vortex | |||
| Restrainer or Decapicone | |||
| Narrow runway | ~70-cm-long, ~5-cm-wide with ~5-cm-high walls. | ||
| Reagents | |||
| Fluorescently labelled oligonucleotides (siGLO) | GE Healthcare Dharmacon INC | D0016300120 | |
| 10% sterile D-glucose | |||
| Antagomir-29 | Exiqon | custom synthesis | |
| Antagomir-control | Exiqon | custom synthesis | |
| Neuropeptide RVG | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Neuropeptide RVM | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Altro | |||
| Cotton | |||
| Warm water | |||
| Insulin syringes | |||
| Absorbent sheets | |||
| Ink | |||
| Brush | |||
| Antiseptic |
Riferimenti
- Roshan, R., Ghosh, T., Scaria, V., Pillai, B. MicroRNAs: novel therapeutic targets in neurodegenerative diseases. Drug discovery today. 14, 1123-1129 (2009).
- Maes, O. C., Chertkow, H. M., Wang, E., Schipper, H. M. MicroRNA: Implications for Alzheimer Disease and other Human CNS Disorders. Current Genomics. 10, 154-168 (2009).
- Soifer, H. S., Rossi, J. J., Saetrom, P. MicroRNAs in Disease and Potential Therapeutic Applications. Mol Ther. 15, 2070-2079 (2007).
- Bader, A. G., Brown, D., Winkler, M. The Promise of MicroRNA Replacement Therapy. Cancer research. 70, 7027-7030 (2010).
- Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3, 1-17 (2012).
- Trang, P., et al. Systemic Delivery of Tumor Suppressor microRNA Mimics Using a Neutral Lipid Emulsion Inhibits Lung Tumors in Mice. Molecular Therapy. 19, 1116-1122 (2011).
- Barbash, S., Hanin, G., Soreq, H. Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome. J Vis Exp. (76), e50170 (2013).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
- Roshan, R., et al. Brain-specific knockdown of miR-29 results in neuronal cell death and ataxia in mice. RNA. 20, 1287-1297 (2014).
- Kaur, H., Wengel, J., Maiti, S. Thermodynamics of DNA−RNA Heteroduplex Formation: Effects of Locked Nucleic Acid Nucleotides Incorporated into the DNA Strand. Biochimica. 47, 1218-1227 (2008).
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, D140-D144 (2006).
- Kaur, H., Babu, B. R., Maiti, S. Perspectives on Chemistry and Therapeutic Applications of Locked Nucleic Acid (LNA). Chemical Reviews. 107, 4672-4697 (2007).
- Guyenet, S. J., et al. A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia. J. Vis. Exp. (39), (2010).
- Bergen, J. M., Park, I. -. K., Horner, P. J., Pun, S. H. Nonviral Approaches for Neuronal Delivery of Nucleic Acids. Pharmaceutical Research. 25, 983-998 (2008).
- Zou, L. -. L., Ma, J. -. L., Wang, T., Yang, T. -. B., Liu, C. -. B. Cell-Penetrating Peptide-Mediated Therapeutic Molecule Delivery into the Central Nervous System. Current Neuropharmacology. 11, 197-208 (2013).
- Hwang, D. W., et al. A brain-targeted rabies virus glycoprotein-disulfide linked PEI nanocarrier for delivery of neurogenic microRNA. Biomaterials. 32, 4968-4975 (2011).
