Una alternativa semplice per iniezione stereotassica per Brain Knockdown specifico miRNA
Summary
MicroRNAs play crucial roles in the brain and are potential targets for modeling neuro-degeneration. However, perturbing miRNA levels is challenging due to the short length of miRNA and inaccessibility of the brain tissue. This video presents a method for antagomir design and brain specific delivery using a neuropeptide in mice.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression. In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the correct expression of microRNAs. Perturbation of microRNAs in the brain can be used to model neurodegenerative diseases by modulating neuronal cell death. Currently, stereotactic injection is used to deliver miRNA knockdown agents to specific location in the brain. Here, we discuss strategies to design antagomirs against miRNA with locked nucleotide modifications (LNA). Subsequently describe a method for brain specific delivery of antagomirs, uniformly across different regions of the brain. This method is simple and widely applicable since it overcomes the surgery, associated injury and limitation of local delivery in stereotactic injections. We prepared a complex of neurotropic, cell-penetrating peptide Rabies Virus Glycoprotein (RVG) with antagomir against miRNA-29 and injected through tail vein, to specifically deliver in the brain. The antagomir design incorporated features that allow specific targeting of the miRNA and formation of non-covalent complexes with the peptide. The knock-down of the miRNA in neuronal cells, resulted in apoptotic cell death and associated behavioural defects. Thus, the method can be used for acute models of neuro-degeneration through the perturbation of miRNAs.
Introduction
I microRNA sono emersi come nuovi bersagli terapeutici per il loro ruolo universale nella regolazione dell'espressione genica e prova diretta per il coinvolgimento nella malattia. MiRNA sono allo studio attivamente per il loro potenziale come bersagli farmacologici 1,2. Inoltre, alterazioni nell'espressione di miRNA sono associati a diverse malattie 3 e simulazione di questi cambiamenti perturbazione artificiale dell'espressione dei miRNA possono essere utilizzati per studiare i meccanismi cellulari coinvolti nella manifestazione della malattia. Tessuto specifico di consegna di farmaci destinati miRNA è attualmente una delle principali sfide per lo sviluppo di farmaci a base di miRNA. Antagomirs e imita miRNA sono agenti promettenti per perturbare i livelli di miRNA 4-6. Tuttavia, funzioni speciali che migliorano la loro specificità ed efficacia devono essere incorporato nel design di antagomirs prima di poter essere utilizzati di vivo perturbazione dell'espressione dei miRNA.
I microRNA sono particolarmente rilevanti come bersagli in neurodegenerativa attualmente incurabile e malattie neuro-sviluppo. La barriera emato-encefalica pone una limitazione alla consegna antagomirs nel cervello. Iniezioni stereotassica sono ampiamente utilizzati in modelli di roditori per consegnare molecole in posizioni specifiche nel cervello 7. Richiede abilità, ingenti investimenti in strumentazione e tempo. Iniezioni stereotassica sono invasivi, comporta un intervento chirurgico, causare almeno lievi lesioni e sono limitate alla consegna locale. L'uso di cellule penetrante peptidi con una preferenza per i neuroni di targeting può contrastare queste limitazioni dal momento che possono essere forniti per via trans-vascolare ma violare la barriera emato-encefalica. Tale peptide derivato dal virus della rabbia glicoproteina (RVG), è stato precedentemente usati per fornire siRNA contro l'encefalite giapponese di virus nei topi 8. Abbiamo trovato che l'uso del peptide per antagomir consegna, miRNA può essere efficacemente abbattuto nel cervello di topo 9.
ONTENUTO "> La seconda grande sfida di miRNA knock-down nasce dalla piccola dimensione del miRNA e la presenza di isoforme sequenza strettamente correlati. Prendiamo l'esempio di MMU-miR 29-famiglia che si compone di tre isoforme strettamente correlati, miR-29a , b e c. antagomirs sono generalmente modificati lungo la catena per aumentare la loro stabilità e renderli resistenti agli attacchi di nucleasi. Locked Nucleic Acids (LNA) offre un ulteriore vantaggio di migliorare la stabilità termica e anche portare a bersaglio degrado di là sterico 10. Introdurre modifiche tutte lungo la catena può essere efficace ma costoso. Abbiamo visto in precedenza che modifiche oltre un numero ottimale non può migliorare ulteriormente l'efficacia. Il design del antagomir comporta quindi la modifica ottimale del antagomir.Per il complesso antagomir non covalente con il peptide neurotropica, una carica epta all'estensione nona-arginina è usato. D-Argininaresidui sono utilizzati poiché conferiscono maggiore stabilità in quanto non sono suscettibili di clivaggio da proteasi. Epta a tratti nona-arginina agire agenti cellulari penetrante come efficienti, anche se non conferiscono tipo di cellula specificità. Con covalentemente collegando il peptide RVG al linker nona-arginina, un neurotropica, cellule penetrante peptide è stato generato. I residui carichi positivamente del peptide interagiscono con scheletro dell'acido nucleico carica negativa, per formare complessi. Questi complessi possono essere utilizzati per trasfettare efficacemente DNA o RNA in cellule in coltura e in vivo nei tessuti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here we demonstrate a widely accessible methodology to study the effects of miRNA modulation. Currently, most attempts at in vivo characterization of miRNA functions involve the creation of knockout mice or a transgenic that expresses a miRNA sponge. Most miRNAs, even the cell type specific ones are expressed in more than one organ. For instance, miRNAs initially thought to be specific to the hematopoietic system are also expressed in the brain, due to the presence of microglia. Thus even a cell type specifi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Souvik Maiti for help in designing the antagomirs. We also acknowledge Rangeetha J. Naik, Rakesh Dey, and Bijay Pattnaik for their help with experimental methods. This work was funded by the Council of Scientific and Industrial Research (BSC0123). HS, MV and RR acknowledge fellowship from the Council of Scientific and Industrial Research, India. MAS acknowledge fellowship from the University Grants Commission, India.
Materials
| Vortex | |||
| Restrainer or Decapicone | |||
| Narrow runway | ~70-cm-long, ~5-cm-wide with ~5-cm-high walls. | ||
| Reagents | |||
| Fluorescently labelled oligonucleotides (siGLO) | GE Healthcare Dharmacon INC | D0016300120 | |
| 10% sterile D-glucose | |||
| Antagomir-29 | Exiqon | custom synthesis | |
| Antagomir-control | Exiqon | custom synthesis | |
| Neuropeptide RVG | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Neuropeptide RVM | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Altro | |||
| Cotton | |||
| Warm water | |||
| Insulin syringes | |||
| Absorbent sheets | |||
| Ink | |||
| Brush | |||
| Antiseptic |
Riferimenti
- Roshan, R., Ghosh, T., Scaria, V., Pillai, B. MicroRNAs: novel therapeutic targets in neurodegenerative diseases. Drug discovery today. 14, 1123-1129 (2009).
- Maes, O. C., Chertkow, H. M., Wang, E., Schipper, H. M. MicroRNA: Implications for Alzheimer Disease and other Human CNS Disorders. Current Genomics. 10, 154-168 (2009).
- Soifer, H. S., Rossi, J. J., Saetrom, P. MicroRNAs in Disease and Potential Therapeutic Applications. Mol Ther. 15, 2070-2079 (2007).
- Bader, A. G., Brown, D., Winkler, M. The Promise of MicroRNA Replacement Therapy. Cancer research. 70, 7027-7030 (2010).
- Stenvang, J., Petri, A., Lindow, M., Obad, S., Kauppinen, S. Inhibition of microRNA function by antimiR oligonucleotides. Silence. 3, 1-17 (2012).
- Trang, P., et al. Systemic Delivery of Tumor Suppressor microRNA Mimics Using a Neutral Lipid Emulsion Inhibits Lung Tumors in Mice. Molecular Therapy. 19, 1116-1122 (2011).
- Barbash, S., Hanin, G., Soreq, H. Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome. J Vis Exp. (76), e50170 (2013).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
- Roshan, R., et al. Brain-specific knockdown of miR-29 results in neuronal cell death and ataxia in mice. RNA. 20, 1287-1297 (2014).
- Kaur, H., Wengel, J., Maiti, S. Thermodynamics of DNA−RNA Heteroduplex Formation: Effects of Locked Nucleic Acid Nucleotides Incorporated into the DNA Strand. Biochimica. 47, 1218-1227 (2008).
- Griffiths-Jones, S., Grocock, R. J., Van Dongen, S., Bateman, A., Enright, A. J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. Nucleic Acids Research. 34, D140-D144 (2006).
- Kaur, H., Babu, B. R., Maiti, S. Perspectives on Chemistry and Therapeutic Applications of Locked Nucleic Acid (LNA). Chemical Reviews. 107, 4672-4697 (2007).
- Guyenet, S. J., et al. A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia. J. Vis. Exp. (39), (2010).
- Bergen, J. M., Park, I. -. K., Horner, P. J., Pun, S. H. Nonviral Approaches for Neuronal Delivery of Nucleic Acids. Pharmaceutical Research. 25, 983-998 (2008).
- Zou, L. -. L., Ma, J. -. L., Wang, T., Yang, T. -. B., Liu, C. -. B. Cell-Penetrating Peptide-Mediated Therapeutic Molecule Delivery into the Central Nervous System. Current Neuropharmacology. 11, 197-208 (2013).
- Hwang, D. W., et al. A brain-targeted rabies virus glycoprotein-disulfide linked PEI nanocarrier for delivery of neurogenic microRNA. Biomaterials. 32, 4968-4975 (2011).
