I microRNA svolgono ruoli cruciali nel cervello e sono potenziali bersagli per la modellazione della neurodegenerazione. Tuttavia, perturbare i livelli di miRNA è difficile a causa della breve lunghezza dei miRNA e dell'inaccessibilità del tessuto cerebrale. Questo video presenta un metodo per la progettazione di antagomir e la somministrazione di antagomir specifici per il cervello utilizzando un neuropeptide nei topi.
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Articolo metodologico
Una alternativa semplice per iniezione stereotassica per Brain Knockdown specifico miRNA
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I microRNA (miRNA) sono regolatori chiave dell'espressione genica. Nel cervello, processi vitali come il neurosviluppo e le funzioni neuronali dipendono dalla corretta espressione dei microRNA. La perturbazione dei microRNA nel cervello può essere utilizzata per modellare le malattie neurodegenerative modulando la morte delle cellule neuronali. Attualmente, l'iniezione stereotassica viene utilizzata per fornire agenti di knockdown dei miRNA in una posizione specifica nel cervello. Qui, discutiamo le strategie per progettare antagomiri contro i miRNA con modificazioni nucleotidiche bloccate (LNA). Successivamente descrivere un metodo per la somministrazione di antagomiri nel cervello, in modo uniforme in diverse regioni del cervello. Questo metodo è semplice e ampiamente applicabile poiché supera l'intervento chirurgico, le lesioni associate e la limitazione della somministrazione locale nelle iniezioni stereotassiche. Abbiamo preparato un complesso di glicoproteina del virus della rabbia (RVG) peptide neurotropico che penetra nelle cellule con antagomir contro miRNA-29 e iniettato attraverso la vena caudale, per veicolarlo specificamente nel cervello. Il design dell'antagomir incorporava caratteristiche che consentono il targeting specifico del miRNA e la formazione di complessi non covalenti con il peptide. Il knock-down del miRNA nelle cellule neuronali ha provocato la morte cellulare apoptotica e i difetti comportamentali associati. Pertanto, il metodo può essere utilizzato per modelli acuti di neurodegenerazione attraverso la perturbazione di miRNA.
Introduzione
I microRNA sono emersi come nuovi bersagli terapeutici per il loro ruolo universale nella regolazione dell'espressione genica e prova diretta per il coinvolgimento nella malattia. MiRNA sono allo studio attivamente per il loro potenziale come bersagli farmacologici 1,2. Inoltre, alterazioni nell'espressione di miRNA sono associati a diverse malattie 3 e simulazione di questi cambiamenti perturbazione artificiale dell'espressione dei miRNA possono essere utilizzati per studiare i meccanismi cellulari coinvolti nella manifestazione della malattia. Tessuto specifico di consegna di farmaci destinati miRNA è attualmente una delle principa....
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Protocollo
Nota: Tutti i procedimenti tra cui soggetti animali sono stati approvati dal Comitato Etico Istituzionale Animali (AICE) presso l'Istituto di Genomica e Biologia Integrativa, Nuova Delhi (IGIB / AEC / 10/2013). Questo protocollo è specificamente adattato per somministrazione mirata di antagomir-29 nel cervello e atterramento di miR-29.
1. antagomir Design Strategy
- Recuperare il maturo sequenza di miRNA da miRBase 11 (http://www.mirbase.org/).
- Recuperare le sequenze di relativi familiari miRNA utilizzando il link "Gene Famiglia" nel record miRBase
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Risultati
Utilizzando la procedura qui presentata, complessi di oligonucleotide 50microgram fluorescente (FLO) e ~ 850microgram RVG peptide di 01:15 rapporto molare di carica (FLO: peptide) sono stati preparati e iniettato una sola volta attraverso vena della coda. Complesso di non neurotropi rabbia Virus Matrix (RVM) e peptide FLO è stato utilizzato come controllo di consegna. Il giorno dopo, i topi cervello e il fegato sono stati isolati e sospensioni singola cella sono stati preparati. Le cellule sono state osservate al micros.......
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Discussione
Qui dimostriamo una metodologia ampiamente accessibile per studiare gli effetti della modulazione dei miRNA. Attualmente, la maggior parte dei tentativi di caratterizzazione in vivo delle funzioni dei miRNA comporta la creazione di topi knockout o di un transgenico che esprime una spugna di miRNA. La maggior parte dei miRNA, anche quelli specifici del tipo di cellula, sono espressi in più di un organo. Ad esempio, i miRNA inizialmente ritenuti specifici del sistema ematopoietico sono espressi anche nel cervel.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Souvik Maiti per l'aiuto nella progettazione degli antagomir. Ringraziamo anche Rangeetha J. Naik, Rakesh Dey e Bijay Pattnaik per il loro aiuto con i metodi sperimentali. Questo lavoro è stato finanziato dal Consiglio per la ricerca scientifica e industriale (BSC0123). HS, MV e RR riconoscono la borsa di studio del Council of Scientific and Industrial Research, India. Il MAS riconosce la borsa di studio della Commissione per le sovvenzioni universitarie, India.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Vortice | |||
| Trattenitore o Decapicone | |||
| Pista | ~ 70 cm di lunghezza, ~ 5 cm di larghezza con pareti alte ~ 5 cm. | ||
| Reagenti | |||
| Oligonucleotidi marcati in fluorescenza (siGLO) | GE Healthcare Dharmacon INC | D0016300120 | |
| 10% D-glucosio | |||
| Antagomir-29 | Sintesi | Exiqon | |
| Controllo Antagomir | Sintesi | Exiqon | |
| Neuropeptide RVG | G.L.Biochem ( Shanghai) Ltd. | sintesi personalizzata | >98% di purezza |
| Neuropeptide RVM | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | sintesi personalizzata | >98% di purezza |
| Altro | |||
| Cotone | |||
| Acqua | |||
| Siringhe per insulina | |||
| assorbenti | |||
| Pennello per | |||
| inchiostro | |||
| Antisettico |
Riferimenti
- Roshan, R., Ghosh, T., Scaria, V., Pillai, B. MicroRNAs: novel therapeutic targets in neurodegenerative diseases. Drug discovery today. 14, 1123-1129 (2009).
- Maes, O. C., Chertkow, H. M., Wang, E., Schipper, H. M. MicroRNA: Implications for Alzheimer Disease an....
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Ristampe e permessi
