Une alternative simple à injection stéréotaxique pour Brain Knockdown spécifique de miARN
Summary
MicroRNAs play crucial roles in the brain and are potential targets for modeling neuro-degeneration. However, perturbing miRNA levels is challenging due to the short length of miRNA and inaccessibility of the brain tissue. This video presents a method for antagomir design and brain specific delivery using a neuropeptide in mice.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) are key regulators of gene expression. In the brain, vital processes like neurodevelopment and neuronal functions depend on the correct expression of microRNAs. Perturbation of microRNAs in the brain can be used to model neurodegenerative diseases by modulating neuronal cell death. Currently, stereotactic injection is used to deliver miRNA knockdown agents to specific location in the brain. Here, we discuss strategies to design antagomirs against miRNA with locked nucleotide modifications (LNA). Subsequently describe a method for brain specific delivery of antagomirs, uniformly across different regions of the brain. This method is simple and widely applicable since it overcomes the surgery, associated injury and limitation of local delivery in stereotactic injections. We prepared a complex of neurotropic, cell-penetrating peptide Rabies Virus Glycoprotein (RVG) with antagomir against miRNA-29 and injected through tail vein, to specifically deliver in the brain. The antagomir design incorporated features that allow specific targeting of the miRNA and formation of non-covalent complexes with the peptide. The knock-down of the miRNA in neuronal cells, resulted in apoptotic cell death and associated behavioural defects. Thus, the method can be used for acute models of neuro-degeneration through the perturbation of miRNAs.
Introduction
Les microARN ont émergé comme de nouvelles cibles thérapeutiques en raison de leur rôle universel dans la régulation de l'expression des gènes et de preuve directe de l'implication dans la maladie. MiRNAs sont activement explorées pour leur potentiel en tant que médicament cible 1,2. En outre, dans l'expression des miARN altérations sont associées à plusieurs maladies 3 et simulation de ces changements par une perturbation artificielle d'expression des miARN peuvent être utilisées pour étudier les voies cellulaires impliquées dans la manifestation de la maladie. Livraison spécifique tissulaire de médicaments ciblant miARN est actuellement un défi majeur pour le développement de médicaments à base de miARN. Antagomirs et imite miARN sont des agents prometteurs pour perturber les niveaux de miARN 4-6. Cependant, les caractéristiques spéciales qui améliorent leur spécificité et l'efficacité doivent être intégrées dans la conception des antagomirs avant qu'ils ne puissent être utilisés pour perturbation in vivo d'expression des miARN.
Les microARN sont particulièrement pertinentes comme cibles dans neurodégénérative actuellement incurable et les maladies neuro-développementale. La barrière hémato-encéphalique constitue une restriction à la fourniture de antagomirs dans le cerveau. Injections stéréotaxiques sont largement utilisés dans les modèles de rongeurs pour délivrer des molécules à des endroits précis dans le cerveau 7. Il exige des compétences, d'importants investissements dans l'instrumentation et de l'heure. Injections stéréotaxiques sont envahissantes, implique la chirurgie, provoquer au moins des blessures légères et sont limitées à la livraison locale. L'utilisation de peptides de pénétration de cellules avec une préférence pour les neurones de ciblage peut contrer ces limitations, car ils peuvent être livrés par la voie trans-vasculaire, mais franchir la barrière hémato-encéphalique. Un tel peptide dérivé de la glycoprotéine virus de la rage (RVG), a déjà été utilisé pour délivrer siRNA contre le virus de l'encéphalite japonaise chez des souris 8. Nous avons trouvé que l'utilisation du peptide pour antagomir livraison, miARN peut être efficacement éliminé dans le cerveau de souris 9.
ontenu "> Le deuxième défi majeur de miARN knock-down découle de la petite taille des miARN et la présence d'isoformes de séquences étroitement liés. Nous prenons l'exemple de la MMU-miR-29 famille qui se compose de trois isoformes étroitement liés, miR-29a , b et c. antagomirs sont aussi généralement modifié le long de l'épine dorsale d'augmenter leur stabilité et les rendre résistant à l'attaque par des nucléases. Verrouillé Nucleic Acids (LNA) offrent un autre avantage à ce qu'ils améliorent la stabilité thermique et même conduire à cibler la dégradation au cours et au-delà 10 encombrement stérique. Présentation des modifications tout le long du squelette peut être efficace mais coûteux. Nous avons vu précédemment que des modifications au-delà d'un nombre optimal ne peuvent pas améliorer encore l'efficacité. La conception de l'antagomir implique donc la modification de la antagomir optimale.Pour le complexe antagomir non covalente avec le peptide neurotrophique, un hepta chargé de l'extension de nona-arginine est utilisé. D-arginineles résidus sont utilisés car ils confèrent une meilleure stabilité car ils ne sont pas sensibles au clivage par des proteases. Hepta à tronçons de nona-arginine Loi sur les agents de pénétration de cellules comme efficaces, même si elles ne confèrent pas de spécificité de type cellulaire. Par liaison covalente du peptide RVG au lieur nona-arginine, un neurotrope, pénétrant dans les cellules peptide a été généré. Les résidus chargés positivement du peptide d'interagir avec le squelette d'acide nucléique chargé négativement, pour former des complexes. Ces complexes peuvent être utilisés pour transfecter efficacement ADN ou d'ARN dans des cellules en culture et in vivo dans les tissus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here we demonstrate a widely accessible methodology to study the effects of miRNA modulation. Currently, most attempts at in vivo characterization of miRNA functions involve the creation of knockout mice or a transgenic that expresses a miRNA sponge. Most miRNAs, even the cell type specific ones are expressed in more than one organ. For instance, miRNAs initially thought to be specific to the hematopoietic system are also expressed in the brain, due to the presence of microglia. Thus even a cell type specifi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Souvik Maiti for help in designing the antagomirs. We also acknowledge Rangeetha J. Naik, Rakesh Dey, and Bijay Pattnaik for their help with experimental methods. This work was funded by the Council of Scientific and Industrial Research (BSC0123). HS, MV and RR acknowledge fellowship from the Council of Scientific and Industrial Research, India. MAS acknowledge fellowship from the University Grants Commission, India.
Materials
| Vortex | |||
| Restrainer or Decapicone | |||
| Narrow runway | ~70-cm-long, ~5-cm-wide with ~5-cm-high walls. | ||
| Reagents | |||
| Fluorescently labelled oligonucleotides (siGLO) | GE Healthcare Dharmacon INC | D0016300120 | |
| 10% sterile D-glucose | |||
| Antagomir-29 | Exiqon | custom synthesis | |
| Antagomir-control | Exiqon | custom synthesis | |
| Neuropeptide RVG | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Neuropeptide RVM | G.L.Biochem (Shanghai) Ltd. | custom synthesis | >98% purity |
| Altro | |||
| Cotton | |||
| Warm water | |||
| Insulin syringes | |||
| Absorbent sheets | |||
| Ink | |||
| Brush | |||
| Antiseptic |
Riferimenti
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