Nasal Tücher für Influenza-A-Virus-Erkennung und Isolierung von Schweine

Summary

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Abstract

Überwachung der Influenza-A-Viren bei Schweinen ist entscheidend für die menschliche und tierische Gesundheit, weil Influenza A-Virus schnell entwickelt sich in Schweinepopulationen und neue Stämme werden laufend entstehen. Schweine sind in der Lage, die von verschiedenen Abstammungslinien von Influenza A-Virus so dass sie wichtige Wirte für die Entstehung und Aufrechterhaltung von neuartigen Influenza A-Virus-Stämmen infiziert werden. Sampling Schweine in diverse Einstellungen wie kommerziellen Schweinefarmen, landwirtschaftliche Messen und Märkten für lebende Tiere ist wichtig, einen umfassenden Überblick über die derzeit zirkulierenden IAV-Stämme bereitzustellen. Der aktuelle Goldstandard Schlachttier- Sampling-Technik (dh Sammlung von Nasenabstrichen) ist arbeitsintensiv, weil sie körperliche Zurückhaltung der Schweine erfordert. Nasen Tücher beinhalten Reiben eines Stückes Stoff durch die Schnauze des Schweins mit minimalen oder keiner Beeinträchtigung des Tieres. Die Nasen wischen Verfahren ist einfach durchzuführen und nicht Personal mit professionellen Veterinär- oder Tier Handling Ausbildung. While etwas weniger empfindlich als Nasenabstriche sind Virenerkennung und Isolation gewählten Standort gewährleisten, stellen Nasen wischt eine tragfähige Alternative zum Abtasten einzelner Schweine bei niedriger Belastung Probenahmeverfahren erforderlich sind. Das Verfahren Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte, um eine lebensfähige Nasen sammeln wischen von einem einzelnen Schwein.

Introduction

Influenza-A-Viren (IAV) verursachen Atemwegserkrankungen in vielen Arten, darunter Hausgeflügel, Schweinen und Menschen. Durch Neuordnung der segmentierten IAV Genom schnelle virale Evolution kann auftreten, und neue IAV Stämme häufig auftauchen. Schweine sind eine Spezies, die als Mischgefäß für die Neuordnung der iAVS von mehreren Wirtsarten dienen können ^1. Derzeit gibt es drei Haupttypen von IAV häufigsten verwendete unter den nordamerikanischen Schweinen (H1N1, H1N2, H3N2) im Umlauf, aber mehrere IAV Einführungen von Menschen haben innerhalb dieser Subtypen führte zu umfangreichen IAV Vielfalt. ² schnelle Entwicklung der iAVS infizieren Schweine ist seit 1998, als eine dreifache Reassortante IAV enthält Gensegmente aus menschlichen, Vogelgrippe und Schweineviren ³ verbreitete sich unter den Schweinen in den Vereinigten Staaten deutlich. ⁴ Die interne Gen Segmente von diesem Dreifach Reassortante IAV vor sehr weit verbreitet unter iAVS derzeit infizieren Schweine. ⁵

"> Weltweit ist die IAV eine wesentliche Ursache für Atemwegserkrankungen bei Schweinen, in der typischen klinischen Symptome sind Fieber, Appetitlosigkeit, Lethargie, Husten, Atemnot, Niesen, Nasenausfluss und schlechte Gewichtszunahme. IAV kann besonders teuer werden, um Betriebe zu säen, wo Fortpflanzungs Versagen aufgrund von IAV induzierte Fieber und schwache geborenen Ferkel wurden dokumentiert ^6,7 Innerhalb der Vereinigten Staaten. wird IAV üblicherweise in kommerziellen Schweinebeständen und der umfangreichen Antigens und Genoms Vielfalt und kontinuierlichen Weiterentwicklung unter IAV infizieren Schweine erfasst hat die Kontrolle über diese behindert Virus. ^8-11

Der öffentlichen Gesundheit über die Entstehung einer Pandemie IAV-Stamm von Reassortierung was Schweine wurden im Jahr 2009 realisiert werden, wenn ein Schwein-Linie IAV enthält Gensegmente aus dem Triple-Reassortante nordamerikanischen Schweine Abstammung und der eurasischen avian artigen Schweine Linie verursachte eine weltweite Pandemie beim Menschen. ¹² Die Pandemie-Virus (A (H1N1) pdm09) verfügt seitmit endemischen Schweine neu angeordneten IAV Stämme ^13,14 und einige dieser neu neu angeordneten Stämme zurück auf den Menschen übertragen worden. ¹⁵ Die Häufigkeit der Reassortierung Veranstaltungen und Entstehung neuer IAV Stämmen mit Pandemie-Potenzial macht die aktive Überwachung der zirkulierenden IAV-Viren bei Schweinen zwingend notwendig, vor allem an der Schweine-Mensch-Schnittstelle.

Die Schweine-Mensch-Schnittstelle ist für die bidirektionale Interspezies-Übertragung von IAV. Mensch-zu-Schweine-Übertragung in kommerziellen Schweineproduktion auftritt, ist für eine große Menge von IAV Vielfalt derzeit in der Schweinepopulation vorhanden verantwortlich. Landwirtschaftsmessen sind die größten Einstellungen für die comingling von Menschen und Schweinen in den Vereinigten Staaten und sind dafür bekannt Stellen für den zoonotischen Übertragung von IAV. ^15-21 Im Jahr 2012, während des Ausbruchs einer Variante H3N2 IAV, 93% der Fälle berichtet, die Teilnahme an eine Landwirtschaftsmesse in den Tagen vor der Krankheitsbeginn. ¹⁵ Genomanalysevon Virusisolaten von Ausstellungs Schweinen gegenüber menschlichen Isolate bestätigte zoonotischen Übertragung. ²¹ Ausstellung Schweine mit IAV infiziert oft nicht klinischen Anzeichen von Krankheit, ^21-23, die die Notwendigkeit einer direkten diagnostischen Tests zu zeigen.

Probenahme von sichtlich kranken Schweine allein nicht erfolgreich IAV Prävalenz identifizieren bei Schweinen und kann nicht herangezogen werden, um neue Stämme von IAV Schwellen unter den Schweinen zu identifizieren. Aktive Überwachung ist für die Erkennung von Schwellen Stämme von IAV in Schweinen und ihre Bedrohung sowohl für Schweine und die öffentliche Gesundheit zu beurteilen unbedingt notwendig. Die meisten IAV Überwachungstätigkeiten sind freiwillig und daher minimal störend Verfahren benötigt werden. Die drei großen Schlachttierprobensammelverfahren für IAV infizieren Schweine sind: Nasenabstrichen, Mundflüssigkeiten und Nasentücher. Aktuelle Empfehlungen zur Probenahme einzelnen Schweine zu IAV-Liste das Einfügen von Kunstfaser erkennen Abstrichtupfer in die Nasenlöcher als die bevorzugte Methodeum Nasensekret und Epithelzellen zu sammeln. ^24,25 Da Schweine können versuchen, dieses Verfahren, ein Team von Fachpersonal muss Schweinen entweder manuell oder mit einer Schlinge, je nach Größe des Tieres zurückhalten zu vermeiden. ^26. Die Zurückhaltung Prozess ist mühsam für die Personal und stressig für die Schweine. Zusätzlich Ausstellung Schweine sind oft in mehreren Wettbewerben auf einer Messe beteiligt, so dass die Wahrnehmung der zusätzlichen Stress auf einem Wettbewerb Tier Besitzer gegenüber den Überwachungs Anstrengungen unternehmen.

Mit Wahrscheinlichkeiten der IAV Erkennung im Bereich von 80-100% in IAV infizierten Beständen, haben Mundflüssigkeiten zu einer beliebten Alternative zu Tupfer für den molekularen Nachweis von IAV in Populationen von Schweinenasen. ^27,28 Zusätzlich kann Mundflüssigkeiten ein breiteres Fenster der bereitzustellen IAV Erkennung als Nasenabstrichen nach Erstinfektion. Allerdings IAV isoliert von Mundflüssigkeiten problematisch gewesen mit nur 50% der Virusisolierung Versuche was IA^{29 V} Erholung.

Verwenden Nasentücher anstelle von Nasenabstrichen bei IAV Überwachung in Schweinen überwindet die oben beschriebenen Einschränkungen. Nasal Tücher nicht die Verwendung eines Rückhalte Snare erfordern und ohne Belastung der Tiere oder Zeugen des Verfahrens durchgeführt werden. Minimale technische Ausbildung ist notwendig, um Nasenwischtücher, die nicht-Tierärzten, einschließlich Schweinebesitzer ermöglicht zu sammeln, um die Überwachungs Proben zu sammeln. Nasen Tücher wurden im Vergleich zu vorher Nasentupfer zum Nachweis und zur Isolierung von Influenza-A-Virus ^{30 und das} detaillierte Protokoll für diese nicht-invasive Methode der Probenahme wird nachstehend beschrieben.

Protocol

Alle Schweine in der Sammlung der folgenden Daten verwendet werden, wurden unter der Ohio State University Institutional Animal Care und Verwenden Committee geschützt (Tiernutzung Protokollnummer 2009A0134-R1). 1. Herstellung der Virustransportmedium und Probensammlung Vials In 37 g Brain Heart Infusion zu 900 ml gereinigtem Wasser und mischen mit einem Rührstab und einem Magnetrührer unter Erwärmen auf 70 ° C, um das Pulver vollständig aufzulösen. Autoklavieren d…

Representative Results

Erfolgreiche Anwendung dieser Methode ergibt rRT-PCR ergibt sich, dass, begleitet mit der Verwendung eines internen Kontroll während der RNA-Extraktion und rRT-PCR, hat Show Proben enthalten PCR-Inhibitoren in jedem Umwelt Trümmern hob während der Probenahme. Nach der Probenimpfung sollte Virusisolierung Brunnen frei von sichtbaren Umwelt Schutt aus der Probe. Es gibt vernünftige Vereinbarung zwischen rRT-PCR-Ergebnisse und die Virusisolierung Ergebnisse mit dem Verständnis, dass PCR ergibt oft eine höhere IAV pos…

Discussion

Sammeln von Proben von Schweinen unter Verwendung von Polyester-bestückte Nasenabstrichen hat bei der Durchführung von IAV Überwachung bewährt; jedoch die Verwendung des Nasenabstrich Verfahren behindert Überwachungsbemühungen aufgrund der erforderlichen Verwendung einer Schlinge zur Zurückhaltung. Nasal Tücher stellen eine Weiterentwicklung der aktuellen Schweinestichprobentechniken, um Stress auf die Menschen und Schweinen während der Probenahme zu minimieren. Während das Verfahren seit entwickelt und in Aus…

Materials

BBL Brain Heart Infusion	Becton, Dickinson and Company	211059
Penicillin G Sodium Salt	MP Biomedicals, LLC	021194537	1500 u/mg
Streptomycin Sulfate	AMRESCO LLC	0382
Gentamicin Solution	Mediatech, Inc.	30-005-CR	50 mg/ml
Amphotericin B Solution	Fisher	S 24 25	250 ug/ml
Kanamycin Sulfate	Teknova	K2105	5000 ug/ml
TPP Rapid Filtermax System	TPP Techno Plastic Products AG	99150
Nalgen Diagnostic Bottles	Thermo Scientific	342002-9025	HDPE with white PP closure
Dermacea Gauze Sponge, 8 ply	Covidien	441211	5.08 cm × 5.08 cm (2 in. × 2 in)
Nitrile Exam Gloves	Saftey Choice	19-170-010 (A-D)