Nasal Toallitas para Influenza A Detección de Virus y aislamiento de los cerdos

Summary

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Abstract

La vigilancia de los virus de la gripe A en cerdos es fundamental para la salud humana y animal debido a la influenza A virus evoluciona rápidamente en poblaciones porcinas y las nuevas cepas están surgiendo continuamente. Los cerdos son capaces de ser infectados por diversos linajes del virus de la gripe A haciéndolos anfitriones importantes para la aparición y el mantenimiento de la nueva influenza A cepas del virus. Muestreo cerdos en diversos entornos, como las granjas comerciales de cerdos, ferias agrícolas y mercados de animales vivos es importante proporcionar una visión completa de las cepas circulantes de IAV. La técnica actual estándar de oro ante mortem de muestreo (es decir, colección de hisopos nasales) es mano de obra intensiva, ya que requiere la restricción física de los cerdos. Toallitas nasales implican frotar un trozo de tela a través del hocico del cerdo con mínima o ninguna restricción del animal. La nasal limpie procedimiento es sencillo de realizar y no requiere personal con veterinaria profesional o capacitación manejo de animales. While ligeramente menos sensible que hisopos nasales, las tasas de detección de virus y de aislamiento son adecuados para hacer nasal limpia una alternativa viable para el muestreo de los cerdos individuales cuando se requieren métodos de muestreo de baja tensión. El protocolo de procedimiento describe los pasos necesarios para cobrar una nasal viable limpie de un cerdo individual.

Introduction

Los virus de influenza A (IAV) causan enfermedades respiratorias en muchas especies, incluyendo aves domésticas, cerdos y seres humanos. Debido al reordenamiento del genoma segmentado IAV rápida evolución viral puede ocurrir y nuevas cepas IAV surgir con frecuencia. Cerdos son una especie que puede servir como un recipiente de mezcla para la redistribución de los virus de este tipo a partir de múltiples especies huésped. ¹ Actualmente hay tres subtipos principales de IAV comúnmente circulan entre los cerdos de América del Norte (H1N1, H1N2, H3N2), pero múltiples introducciones IAV de los seres humanos tienen llevó a una extensa diversidad IAV dentro de esos subtipos. ² La rápida evolución de virus de este tipo que infectan cerdos ha sido evidente desde 1998 cuando un triple recombinante IAV que contiene segmentos de genes de virus humanos, aviares y porcinos ³ se generalizó entre los cerdos en los Estados Unidos. ⁴ El gen interno segmentos de esa IAV triple recombinante siguen siendo muy frecuente entre los virus de este tipo actualmente infectan a los cerdos. ⁵

"> A nivel mundial, IAV es una causa importante de enfermedad respiratoria en cerdos en la que los signos clínicos típicos incluyen fiebre, anorexia, letargo, tos, dificultad para respirar, estornudos, secreción nasal y poco aumento de peso. IAV puede ser particularmente costosa para sembrar fincas donde reproductiva fracaso debido a la fiebre inducida IAV y lechones débiles nacido se han documentado. ^6,7 Dentro de los Estados Unidos, IAV se detecta comúnmente en piaras comerciales y la amplia diversidad antigénica y genómica y la evolución continua entre IAV porcina infectar ha dificultado el control de este virus ^8-11.

Problemas de salud pública acerca de la aparición de una cepa IAV pandemia resultante de reordenamiento en el cerdo se dio cuenta en 2009 cuando una IAV porcina linaje que contiene segmentos de genes del linaje porcina norteamericana-triple recombinante y el linaje porcina aviar-como Eurasia causó una pandemia mundial en los seres humanos. ¹² El virus pandémico (A (H1N1) pdm09) tiene desderedistribución génica con porcina endémica IAV cepas ^13,14 y algunas de estas cepas recién reordenadas se han transmitido de nuevo a los seres humanos. ¹⁵ La frecuencia de eventos de reordenamiento y la aparición de nuevas cepas IAV con potencial pandémico hace que la vigilancia activa de los virus circulantes IAV en cerdos imprescindible, sobre todo en la interfase porcina humano.

La interfaz porcina humana es importante para interespecies bidireccional transmisión de IAV. De humano a los cerdos de transmisión que ocurre en la producción porcina comercial es responsable de una gran cantidad de IAV diversidad actualmente presente en la población porcina. Ferias agrícolas son los parámetros más importantes para el comingling de las personas y los cerdos en los Estados Unidos y son conocidos sitios para la transmisión zoonótica de IAV. ^15-21 En 2012, durante el brote de una variante H3N2 IAV, el 93% de los casos reportados asistencia a una feria agrícola en los días antes de la aparición de la enfermedad. ¹⁵ Análisis genómicode los aislamientos virales de cerdos de exhibición frente a las cepas humanas confirmado la transmisión zoonótica. porcina ²¹ Exposición infectado con IAV menudo no muestran signos clínicos de la enfermedad, ^21-23 que indican la necesidad de pruebas diagnósticas directas.

El muestreo de los cerdos visiblemente enfermos por sí sola no identificar con éxito prevalencia IAV en los cerdos y no puede ser invocada para identificar nuevas cepas de IAV emergentes entre los cerdos. La vigilancia activa es absolutamente necesario para la detección de cepas emergentes de IAV en cerdos y para evaluar su amenaza tanto para los cerdos y la salud pública. La mayoría de las actividades de vigilancia IAV son voluntarios y por lo tanto se necesitan métodos mínimamente perturbadores. Los tres principales procedimientos de recogida de muestras ante mortem para IAV infectar cerdos son: hisopos nasales, fluidos orales, nasales y toallitas. Las recomendaciones actuales para el muestreo de los cerdos individuales para detectar lista IAV la inserción de fibra sintética con punta de hisopos en las fosas nasales como el método preferidopara recoger las secreciones nasales y células epiteliales. ^24,25 Debido a que los cerdos pueden tratar de evitar este procedimiento, un equipo de personal capacitado debe contener cerdos ya sea manualmente o con una trampa en función del tamaño del animal. ²⁶ El proceso de retención es laboriosa para el personal y estresante para los cerdos. Además, porcina exposiciones suelen participar en varias competiciones en una feria por lo que la percepción de estrés añadido en un animal de la competencia puede hacer que los propietarios resistente a los esfuerzos de vigilancia.

Con probabilidades de detección IAV que van desde 80-100% en IAV rebaños infectados, fluidos orales se han convertido en una alternativa popular a hisopos nasales para la detección molecular de IAV en las poblaciones de la especie porcina. ^27,28 Además, los fluidos orales pueden proporcionar una ventana más amplia de detección IAV de hisopos nasales después de la infección inicial. Sin embargo, el aislamiento a partir de fluidos orales IAV ha sido problemático con sólo el 50% de los intentos de aislamiento del virus resultante en IAV recuperación. ²⁹

El uso de toallitas nasales en lugar de hisopos nasales durante la vigilancia IAV en cerdos supera las limitaciones descritas anteriormente. Toallitas nasales no requieren el uso de una trampa de restricción y se puede realizar sin hacer hincapié en los animales o los testigos del procedimiento. Es necesaria una formación técnica mínima para recoger trapos nasales, lo que permite a los profesionales no veterinarios, incluidos los propietarios de cerdos, para recoger las muestras de vigilancia. Toallitas nasales fueron previamente en comparación con hisopos nasales para la detección y el aislamiento de virus de influenza A ³⁰ y el protocolo detallado para este método no invasivo de muestreo se describe a continuación.

Protocol

Todos los cerdos utilizados en la recogida de los siguientes datos estaban protegidos bajo el Comité de Animales Institucional de Cuidado y Uso Universidad Estatal de Ohio (uso de animales número de protocolo 2009A0134-R1). 1. Preparación de Viral Medio de Transporte y Recogida de muestras Viales Añadir 37 g de Brain Heart Infusion a 900 ml de agua purificada y mezclar bien con una barra de agitación y un agitador magnético mientras se calienta a 70 ° C para disolver comple…

Representative Results

El uso exitoso de este método produce RT-PCR resulta que, acompañado con el uso de un control interno durante la extracción de RNA y RT-PCR, se muestran muestras no contenían inhibidores de PCR de cualquier residuo ambiental recogió durante el muestreo. Después de la inoculación de la muestra, los pozos de aislamiento del virus deben estar libres de escombros ambiental visible de la muestra. Existe un acuerdo razonable entre los resultados de RT-PCR y los resultados de aislamiento de virus con el entendimiento de…

Discussion

La recolección de muestras de cerdos utilizando hisopos nasales de poliéster con punta ha demostrado ser útil en la realización de la vigilancia IAV; Sin embargo, el uso del procedimiento de hisopo nasal dificulta los esfuerzos de vigilancia debido al uso requerido de un lazo a la moderación. Toallitas nasales representan un refinamiento de las técnicas de muestreo porcina actuales para minimizar el estrés en las personas y cerdos durante la recogida de muestras. Mientras que el método ha sido desarrollado y val…

Materials

BBL Brain Heart Infusion	Becton, Dickinson and Company	211059
Penicillin G Sodium Salt	MP Biomedicals, LLC	021194537	1500 u/mg
Streptomycin Sulfate	AMRESCO LLC	0382
Gentamicin Solution	Mediatech, Inc.	30-005-CR	50 mg/ml
Amphotericin B Solution	Fisher	S 24 25	250 ug/ml
Kanamycin Sulfate	Teknova	K2105	5000 ug/ml
TPP Rapid Filtermax System	TPP Techno Plastic Products AG	99150
Nalgen Diagnostic Bottles	Thermo Scientific	342002-9025	HDPE with white PP closure
Dermacea Gauze Sponge, 8 ply	Covidien	441211	5.08 cm × 5.08 cm (2 in. × 2 in)
Nitrile Exam Gloves	Saftey Choice	19-170-010 (A-D)