JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

تصوير ثلاثي الأبعاد وتحليل الميتوكوندريا داخل الألياف العصبية إينترايبيديرمال البشرية

Published: September 29, 2017
doi:
10.3791/53369
, , ,
1University of Michigan Medical School, 2Department of Neurology,University of Michigan, 3Department of Internal Medicine,University of Michigan

Summary

هذا البروتوكول يستخدم تقنيات التصوير والتحليل (3D) ثلاثي الأبعاد لتصور وتحديد حجم الميتوكوندريا العصب على حدة. التقنيات قابلة للتطبيق على حالات أخرى حيث يتم استخدام إشارة الفلورسنت واحدة لعزل مجموعة فرعية بيانات من آخر إشارة الفلورسنت.

Abstract

والهدف من هذا البروتوكول دراسة الميتوكوندريا داخل الألياف العصبية إينترايبيديرمال. ولذلك، تم تطوير تقنيات تصوير وتحليل 3D لعزل الميتوكوندريا العصب على حدة وتقييم التعديلات التي يسببها مرض الميتوكوندريا في تلميح القاصي من الأعصاب الحسية. يجمع البروتوكول immunohistochemistry الأسفار والفحص المجهري [كنفوكل] وتقنيات تحليل الصور الثلاثية الأبعاد لتصور وتحديد حجم الميتوكوندريا العصب على حدة. يتم تعريف المعلمات مفصلة طوال الإجراءات بغية تقديم مثالاً ملموسا على كيفية استخدام هذه التقنيات لعزل الميتوكوندريا العصب على حدة. الأجسام المضادة استخدمت لتسمية العصب وإشارات المتقدرية داخل أقسام الأنسجة الجلد لكمه الخزعات، الذي أعقب الفلورة غير المباشرة وضع تصور للأعصاب والميتوكوندريا مع إشارة فلورية الخضراء والحمراء على التوالي. الصور ض سلسلة تم الحصول عليها مع الفحص المجهري [كنفوكل] وتم استخدام برمجيات التحليل ثلاثي الأبعاد لمعالجة وتحليل الإشارات. فإنه ليس من الضروري لمتابعة المعلمات المحدد وصف داخل، ولكن من المهم أن تكون متسقة مع تلك التي اختارت في جميع أنحاء تلطيخ، اقتناء وتحليل الخطوات. أن قوة هذا البروتوكول هو أنها تنطبق على مجموعة متنوعة من الظروف حيث يتم استخدام إشارة الفلورسنت واحدة لعزل الإشارات الأخرى التي وإلا سيكون من المستحيل لدراسة وحدها.

Introduction

الميتوكوندريا تخدم الوظائف الخلوية الحيوية التي تشمل إنتاج طاقة الخلية، التخزين المؤقت الكالسيوم، وتنظم نخرية و apoptotic خلية الموت1،،من23. الجهاز العصبي، ارتفاع معدل الأيض مقارنة ب الجسم4 ، مما يوحي بأن الخلايا العصبية تولد درجة عالية من الطاقة الخلوية في شكل أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) عن طريق التنفس المتقدرية. هناك كثير من وثائق الإثبات أن وظائف الخلايا العصبية تعتمد على ATP5، لا سيما في نهايات6. ولذلك، من المهم توزيع الميتوكوندريا في الخلايا العصبية.

الغاية ينظم على مدى السنوات العشر الماضية كثير من المعلومات قد أظهرت أن الاتجار بالأشخاص والتحام الخلايا العصبية الميتوكوندريا. وتشارك البروتينات موتور في توزيع الميتوكوندريا إلى مقصورات الهاتف الخلوي محددة في جميع أنحاء العصبية. الاتجار في الميتوكوندريا بأهمية خاصة نظراً لأن الخلايا العصبية المشروع محاور عصبية و dendrites بعيداً عن سوما. المقام الأول المباشر البروتينات موتور Kinesin anterograde (بعيداً عن سوما) الاتجار في الميتوكوندريا على طول microtubules بينما دينين البروتينات موتور الحركة الرجعية (نحو سوما) مباشرة7،8،9 , 10-وهناك الإشارات الخلوية هذا غشاء الميتوكوندريا المحتملة والتوصيل الاندفاع التي تؤثر على وجود واتجاه المتقدرية الاتجار11،،من1213.

بالإضافة إلى نقل الميتوكوندريا، هناك بروتينات متخصصة لتعريب الميتوكوندريا إلى مقصورات الهاتف الخلوي محددة التي لها مطالب الطاقة العالية، مثل رانفييه للعقد ونهايات8،14، 17-والواقع أن أغلبية الميتوكوندريا ضمن محاور عصبية من غير متحركة9،،من1318. البروتينات المتخصصة مثل الميتوكوندريا مرساة سينتافيلين إلى ميكروتوبوليس على طول محاور عصبية بينما البروتينات الأخرى الارتساء الميتوكوندريا أكتين سيتوسكيليتون19–21. أبلغ عوامل النمو والايونات مثل الكالسيوم لدعم وقف حركة الميتوكوندريا إلى ترجمة لها إلى المناطق التي تكون فيها الحاجة إليها21،،من2223.

مجتمعة، بالاتجار بالبشر والارساء من الميتوكوندريا حيوية بالنسبة لوظيفة مناسبة للخلايا العصبية. ودعما لهذه الاضطراب في الاتجار المتقدرية ارتبط مع ظروف عصبية عدة بما في ذلك مرض الزهايمر، التصلب العضلي الجانبي، شاركو-ماري الأسنان المرض، ومرض هنتنغتون، وراثية التشنجي خزل سفلي، وضمور الألياف البصرية15،،من2425،،من2627. ركزت الدراسات التي أجريت مؤخرا على خلل mitochondrial وعلم الأمراض كآلية محتملة لاعتلال الأعصاب السكري، فقدان الحواس المرتبطة بمرض السكري28،،من2930،31 ،،من3233. الافتراض أن مرض السكري يغير توزيع الميتوكوندريا ضمن إسقاطات حسية تنتهي الأعصاب الجلدي. ولذلك، تم تطوير تقنية لتصور وتحديد حجم الميتوكوندريا داخل الألياف العصبية إينترايبيديرمال (إيينفس)، نصائح القاصي من العقدة الجذر الظهرية أفيرينتس الحسية. الأسلوب الذي يجمع بين immunohistochemistry الأسفار الخاصة mitochondrial وتسميات الألياف العصبية مجهرية [كنفوكل] اقتناء ض سلسلة من الإشارات مع برمجيات التحليل صورة 3D قوية لقياس توزيع العصب على حدة الميتوكوندريا من خزعات لكمه الجلدية البشرية لتحقيق هذا الهدف.

Protocol

تم الحصول على خزعات الجلد لكمه من المواضيع التي تم تجنيدهم من شبكة كبيرة من رعاية الأولية المستندة إلى المجتمع المحلي في مركز السكري جامعة يوتا (سولت لايك سيتي، يوتا). هذه الدراسة التي وافق عليها مجلس جامعة ميشيغان الاستعراض المؤسسي والامتثال لمبادئ “إعلان هلسنكي”. كتب تم الحصول على الموا?…

Representative Results

والتصور والتقدير الكمي الميتوكوندريا داخل إيينفس البشرية إيمونوهيستوتشيميستري fluorescence يسمح للعلامات المتزامنة لإشارات متعددة داخل خزعات الجلد البشري لتصور الأعصاب، الميتوكوندريا، ونوى. صفيحة 96-جيدا طريقة ملائمة لتنظيم الخطو…

Discussion

ويهدف هذا البروتوكول إلى عزل وتحديد وتحليل حجم وتوزيع الميتوكوندريا العصب على حدة داخل إيينفس في 3D من خزعات الجلد البشري. وهناك العديد من الخطوات الهامة في البروتوكول. تم تصميم إيمونوهيستوتشيميستري fluorescence التعويم الحر لوصمة عار وتحليل إشارات متعددة في كل عينة، تقديم منهجية أكثر تنوعاً ل…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

هذا العمل كان يدعمها المعاهد الوطنية للصحة منح K08 NS061039-01A2، “البرنامج” “أبحاث الأمراض العصبية” & الاكتشاف، وا الفريد توبمان معهد الأبحاث الطبية في جامعة ميشيغان. هذا العمل المستخدمة في مورفولوجيا وصورة التحليل الأساسية لمركز أبحاث مرض السكري ميشيغان، تموله “المعاهد الوطنية للصحة منحة” 5 ف 90 كمبوتشيا الديمقراطية-20572 من المعهد الوطني لمرض السكري والجهاز الهضمي وأمراض الكلي. الكتاب يود أن يشكر ج. روبنسون المفرد وألف غوردون سميث (جامعة يوتا) على التبرع السخي من عينات الجلد البشري.

Materials

2% Zamboni's Fixative Newcomer Supply, Middleton, WI  1459A 2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP399-4 To make up 1X PBS
Image-iT FX Signal Enhancer ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts I36933 enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding
Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal) Proteintech Group Inc. Rosemont, IL 14730-1-AP abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody
Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal) abcam, Cambridge, MA ab110333 abbreviated as PDH
Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11034 red-fluorescent conjugated secondaryantibody
Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11032 green-fluorescent conjugated secondaryantibody
Albumin, from Bovine Serum Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A7906-100 abbreviated as BSA
Triton X- 100 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T9284 abbreviated as TX-100
0.22 µm Filter EMD Millipore, Billerica
MA		 MILLEX GP SLGP 033NS 0.22 µm Millipore filter
Parafilm M Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 13-374-10 Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)
Non-calibrated Loop Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 22-032092 inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)
96-well Assay Plate Corning Incorporated, Corning, NY 3603 96-well flat bottom plate
Prolong Gold antifade reagent with DAPI ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts P-36931 DAPI staining of nuclei
Microscope Cover Glass 50 x 24 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-544E Coverslips
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-550-15 Microscope Slides
Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL SP5 Confocal Microscope
Volocity x64 Software  Perkin Elmer, Waltham , MA version 4.4.0 Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing
Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software Bitplane, Concord, MA version 7.7.1 Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis
Excel Microsoft, Redmond, WA version Office 2013 Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features
Optimum Cutting Temperature Compound Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA 4583 abbreviated as OCT
Leica Cryostat Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL CM1850 Cryostat for cutting 50 µm sections
CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0 ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts C10600 Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nicholls, D. G., Budd, S. L. Mitochondria and neuronal survival. Physiol Rev. 80 (1), 315-360 (2000).
  2. Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Ann Rev Cell Dev Biol. 22, 79-99 (2006).
  3. Ni, H. M., Williams, J. A., Ding, W. X. Mitochondrial dynamics and mitochondrial quality control. Redox Biol. 4 (C), 6-13 (2015).
  4. Mink, J. W., Blumenschine, R. J., Adams, D. B. Ratio of central nervous system to body metabolism in vertebrates: its constancy and functional basis. Am J Physiol. 241 (3), R203-R212 (1981).
  5. Ames, A. CNS energy metabolism as related to function. Brain Res Brain Res Rev. 34 (1-2), 42-68 (2000).
  6. Harris, J. J., Jolivet, R., Attwell, D. Synaptic energy use and supply. Neuron. 75 (5), 762-777 (2012).
  7. Hollenbeck, P. J. The pattern and mechanism of mitochondrial transport in axons. Front Biosci. 1, d91-d102 (1996).
  8. Cai, Q., Sheng, Z. H. Mitochondrial transport and docking in axons. Exp Neurol. 218 (2), 257-267 (2009).
  9. Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (6), (2013).
  10. Saxton, W. M., Hollenbeck, P. J. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 125 (Pt 9), 2095-2104 (2012).
  11. Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biol. 11 (12), e1001754 (2013).
  12. Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of ranvier. J Neurosci. 31 (20), 7249-7258 (2011).
  13. Miller, K. E., Sheetz, M. P. Axonal mitochondrial transport and potential are correlated. J Cell Sci. 117, 2791-2804 (2004).
  14. Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61 (4), 541-555 (2009).
  15. Sheng, Z. H., Cai, Q. Mitochondrial transport in neurons: impact on synaptic homeostasis and neurodegeneration. Nat Rev Neurosci. 13 (2), 77-93 (2012).
  16. Berthold, C. H., Fabricius, C., Rydmark, M., Andersen, B. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. I. Occurrence and distribution in large myelinated spinal root axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 925-940 (1993).
  17. Fabricius, C., Berthold, C. H., Rydmark, M. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. II. Occurrence and distribution in large myelinated spinal cord axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 941-954 (1993).
  18. Hollenbeck, P. J., Saxton, W. M. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5411-5419 (2005).
  19. Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (27), 9953-9958 (2014).
  20. Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
  21. Chada, S. R., Hollenbeck, P. J. Nerve growth factor signaling regulates motility and docking of axonal mitochondria. Curr Biol. 14, 1272-1276 (2004).
  22. Yi, M., Weaver, D., Hajnoczky, G. Control of mitochondrial motility and distribution by the calcium signal: a homeostatic circuit. J Cell Biol. 167 (4), 661-672 (2004).
  23. Saotome, M., et al. Bidirectional Ca2+-dependent control of mitochondrial dynamics by the Miro GTPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20728-20733 (2008).
  24. Schon, E. A., Przedborski, S. Mitochondria: the next (neurode)generation. Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).
  25. Petrozzi, L., Ricci, G., Giglioli, N. J., Siciliano, G., Mancuso, M. Mitochondria and neurodegeneration. Biosci Rep. 27 (1-3), 87-104 (2007).
  26. Maresca, A., la Morgia, C., Caporali, L., Valentino, M. L., Carelli, V. The optic nerve: a "mito-window" on mitochondrial neurodegeneration. Mol Cell Neurosci. 55, 62-76 (2013).
  27. Su, B., et al. Abnormal mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 135-142 (2010).
  28. Vincent, A. M., et al. Mitochondrial biogenesis and fission in axons in cell culture and animal models of diabetic neuropathy. Acta Neuropathol. 120 (4), 477-489 (2010).
  29. Leinninger, G. M., et al. Mitochondria in DRG neurons undergo hyperglycemic mediated injury through Bim, Bax and the fission protein Drp1. Neurobiol Dis. 23, 11-22 (2006).
  30. Leinninger, G. M., Edwards, J. L., Lipshaw, M. J., Feldman, E. L. Mechanisms of disease: mitochondria as new therapeutic targets in diabetic neuropathy. Nat Clin Pract Neurol. 2, 620-628 (2006).
  31. Edwards, J. L., et al. Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons. Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).
  32. Fernyhough, P., Roy Chowdhury, S. K., Schmidt, R. E. Mitochondrial stress and the pathogenesis of diabetic neuropathy. Expert Rev Endocrinol Metab. 5 (1), 39-49 (2010).
  33. Schmidt, R. E., Green, K. G., Snipes, L. L., Feng, D. Neuritic dystrophy and neuronopathy in Akita (Ins2(Akita)) diabetic mouse sympathetic ganglia. Exp Neurol. 216 (1), 207-218 (2009).
  34. Penna, G., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
  35. Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
  36. Glas, U., Bahr, G. F. Quantitative study of mitochondria in rat liver. Dry mass, wet mass, volume, and concentration of solids. J Cell Biol. 29 (3), 507-523 (1966).
  37. Bertoni-Freddari, C., et al. Morphological plasticity of synaptic mitochondria during aging. Brain Research. 628 (1-2), 193-200 (1993).
  38. Kaasik, A., Safiulina, D., Zharkovsky, A., Veksler, V. Regulation of mitochondrial matrix volume. Am J Physiol. 292 (1), C157-C163 (2007).
  39. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Meth. 4 (7), 559-561 (2007).
  40. Park, J. Y., et al. Mitochondrial swelling and microtubule depolymerization are associated with energy depletion in axon degeneration. Neuroscience. 238, 258-269 (2013).
  41. Court, F. A., Coleman, M. P. Mitochondria as a central sensor for axonal degenerative stimuli. Trends Neurosci. 35 (6), 364-372 (2012).
  42. Baloh, R. H. Mitochondrial dynamics and peripheral neuropathy. Neuroscientist. 14 (1), 12-18 (2008).
  43. Chowdhury, S. K., Smith, D. R., Fernyhough, P. The role of aberrant mitochondrial bioenergetics in diabetic neuropathy. Neurobiol Dis. 51, 56-65 (2013).
  44. Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
  45. Lauria, G., et al. EFNS guidelines on the use of skin biopsy in the diagnosis of peripheral neuropathy. Eur J Neurol. 12 (10), 747-758 (2005).
  46. Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. Eur J Neurol. 17 (7), e944-e909 (2010).
  47. Umapathi, T., Tan, W. L., Tan, N. C. K., Chan, Y. H. Determinants of epidermal nerve fiber density in normal individuals. Muscle Nerve. 33 (6), 742-746 (2006).
  48. Lauria, G., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J Neurol Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
  49. Lauria, G., et al. Intraepidermal nerve fiber density at the distal leg: a worldwide normative reference study. J Peripher Nerv Syst. 15 (3), 202-207 (2010).
  50. Hamid, H. S., et al. Hyperglycemia- and neuropathy-induced changes in mitochondria within sensory nerves. Ann Clin Transl Neurol. 1 (10), 799-812 (2014).

Tags

3D ImagingMitochondriaIntraepidermal Nerve FibersFluorescence ImmunohistochemistryPGP9.5PDHSecondary AntibodiesSignal EnhancementEpidermal Nerve FibersNeurological Complications
check_url/53369?article_type=t&slug=three-dimensional-imaging-analysis-mitochondria-within-human

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Hamid, H. S., Hayes, J. M., Feldman, E. L., Lentz, S. I. Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers. J. Vis. Exp. (127), e53369, doi:10.3791/53369 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image