JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Proyección de imagen tridimensional y análisis de las mitocondrias en las fibras de nervio humano Intraepidermal

Published: September 29, 2017
doi:
10.3791/53369
, , ,
1University of Michigan Medical School, 2Department of Neurology,University of Michigan, 3Department of Internal Medicine,University of Michigan

Summary

Este protocolo utiliza técnicas de análisis y proyección de imagen (3D) tridimensionales para visualizar y cuantificar las mitocondrias del nervio específico. Las técnicas son aplicables a otras situaciones donde una señal fluorescente se utiliza para aislar un subconjunto de los datos de otra señal fluorescente.

Abstract

El objetivo de este protocolo es estudiar las mitocondrias dentro de las fibras nerviosas intraepidermal. Por lo tanto, se desarrollaron técnicas de análisis y proyección de imagen 3D para aislar mitocondrias nerviosas específicas y evaluar alteraciones inducidas por la enfermedad de las mitocondrias en el extremo distal de los nervios sensitivos. El protocolo combina fluorescencia inmunohistoquímica, microscopia confocal y técnicas de análisis de imagen en 3D para visualizar y cuantificar las mitocondrias del nervio específico. Parámetros detallados se definen a través de los procedimientos con el fin de ofrecer un ejemplo concreto de cómo utilizar estas técnicas para aislar mitocondrias del nervio específico. Anticuerpos se utilizaron para etiqueta del nervio y señales mitocondriales dentro de secciones del tejido de la piel del sacador biopsias, que fue seguido por inmunofluorescencia indirecta para visualizar los nervios y las mitocondrias con una señal fluorescente verde y roja respectivamente. Se adquirieron imágenes de serie Z con microscopia confocal y análisis 3D fue utilizado para procesar y analizar las señales. No es necesario seguir los parámetros exactos descritos dentro, pero es importante ser coherentes con los elegidos a lo largo de la tinción, adquisición y análisis de los pasos. La fuerza de este protocolo es que es aplicable a una variedad amplia de circunstancias donde una señal fluorescente se utiliza para aislar otro tipo de señales que de otro modo sería imposible estudiar solos.

Introduction

Las mitocondrias sirven funciones celulares vitales que incluyen la producción de energía celular, buffer de calcio y regulación necrosis y apoptosis celular muerte1,2,3. El sistema nervioso tiene una tasa metabólica alta en comparación con el cuerpo4 , lo que sugiere que las neuronas generan un alto grado de energía celular en forma de trifosfato de adenosina (ATP) a través de la respiración mitocondrial. Muchos documentos de evidencia que las funciones neuronales dependen de ATP5, especialmente en las sinapsis6. Por lo tanto, es importante la distribución de las mitocondrias dentro de las neuronas.

En los últimos 10 años que una gran cantidad de información ha demostrado que la trata y acoplamiento de las mitocondrias neuronales se regula altamente. Proteínas motoras están implicadas en la distribución de las mitocondrias a compartimentos celulares específicos a lo largo de la neurona. Trata de las mitocondrias es particularmente importante porque las neuronas proyecto axones y las dendritas del soma. Proteínas motoras quinesina dirigen principalmente anterógrada (de soma) trata de mitocondrias a lo largo de los microtúbulos y dineína proteínas motoras directas motilidad retrógrada (hacia el soma)7,8,9 , 10. hay señales celulares tal potencial de membrana mitocondrial y conducción de los impulsos que influyen en la presencia y dirección de mitocondrial tráfico11,12,13.

Además de transportar las mitocondrias, hay proteínas especializadas para localizar las mitocondrias a compartimentos celulares específicos que tienen las demandas de alta energía, tales como nodos de Ranvier y las sinapsis8,14, 17. de hecho, la mayoría de las mitocondrias dentro de axones son no-motile9,13,18. Proteínas especializadas como mitocondrias de anclaje syntaphilin a microtúbulos a lo largo de axones mientras que otras proteínas de anclaje las mitocondrias a la actinia citoesqueleto19–21. Iones como el calcio y factores de crecimiento se han divulgado para apoyar la cesación del movimiento de las mitocondrias para localizar a las regiones donde son necesarios21,22,23.

Tomados en conjunto, la trata y acoplamiento de las mitocondrias son vitales para el funcionamiento correcto de las neuronas. En apoyo de esto, interrupción en el tráfico mitocondrial se ha asociado con varias enfermedades neurológicas como la enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, enfermedad de Huntington, espástica hereditaria paraparesia y atrofia óptica15,24,25,26,27. Estudios recientes se han centrado en la patología y disfunción mitocondrial como un mecanismo potencial para la neuropatía diabética, la pérdida sensorial asociada con diabetes28,29,30,31 ,32,33. La hipótesis es que la diabetes altera la distribución de las mitocondrias dentro de las proyecciones sensoriales del conclusión de nervio cutáneo. Por lo tanto, se desarrolló una técnica para visualizar y cuantificar las mitocondrias dentro de las fibras nerviosas de intraepidermal (IENFs), las extremidades distales de los aferentes sensoriales del ganglio de raíz dorsal. La técnica combina fluorescencia inmunohistoquímica específica mitocondrial y etiquetas fibra de nervio con microscopia confocal de la serie z adquisición de señales con software de análisis de imagen en 3D de gran alcance para medir la distribución del nervio específico mitocondrias de las biopsias del sacador cutáneo humano para lograr este objetivo.

Protocol

las biopsias del sacador de la piel fueron obtenidas de sujetos que fueron reclutados de una red de gran atención primaria comunitaria en el centro de Diabetes de la Universidad de Utah (Salt Lake City, UT). Este estudio fue aprobado por la Junta de revisión institucional de la Universidad de Michigan y el cumplimiento de los principios de la declaración de Helsinki. Se obtuvo consentimiento informado de cada sujeto antes de la prueba por escrito. 1. inmunohistoquímica de fluorescencia…

Representative Results

Visualización y cuantificación de las mitocondrias dentro de IENFs humanos Inmunohistoquímica de fluorescencia permite la rotulación simultánea de múltiples señales en las biopsias de la piel humana para visualizar los nervios, las mitocondrias y núcleos. Una placa de 96 pocillos es una manera conveniente de organizar los pasos en el procedimiento de inmunohistoquímica. La figura 1<…

Discussion

Este protocolo está diseñado para aislar, cuantificar y analizar el tamaño y la distribución de las mitocondrias del nervio específico dentro de IENFs en 3D de las biopsias de la piel humana. Hay varios pasos críticos en el protocolo. La inmunohistoquímica de fluorescencia flotante está diseñado para la mancha y analizar varias señales en cada muestra, proporcionando una metodología más versátil para la investigación exploratoria44,45. Este procedim…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud subvenciones K08 NS061039-01A2, el programa de investigación de Neurología & descubrimiento y el Instituto A. Alfred Taubman Medical Research en la Universidad de Michigan. Este trabajo utiliza la morfología y la base de análisis de imagen del centro de investigación de la Diabetes de Michigan, financiado por los institutos nacionales de salud beca 5P 90 DK-20572 del Instituto Nacional de Diabetes y digestivo y enfermedades del riñón. Los autores desean agradecer a J. Robinson Singleton y Gordon A. Smith (Universidad de Utah) por su generosa donación de muestras de piel humana.

Materials

2% Zamboni's Fixative Newcomer Supply, Middleton, WI  1459A 2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP399-4 To make up 1X PBS
Image-iT FX Signal Enhancer ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts I36933 enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding
Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal) Proteintech Group Inc. Rosemont, IL 14730-1-AP abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody
Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal) abcam, Cambridge, MA ab110333 abbreviated as PDH
Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11034 red-fluorescent conjugated secondaryantibody
Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11032 green-fluorescent conjugated secondaryantibody
Albumin, from Bovine Serum Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A7906-100 abbreviated as BSA
Triton X- 100 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T9284 abbreviated as TX-100
0.22 µm Filter EMD Millipore, Billerica
MA		 MILLEX GP SLGP 033NS 0.22 µm Millipore filter
Parafilm M Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 13-374-10 Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)
Non-calibrated Loop Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 22-032092 inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)
96-well Assay Plate Corning Incorporated, Corning, NY 3603 96-well flat bottom plate
Prolong Gold antifade reagent with DAPI ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts P-36931 DAPI staining of nuclei
Microscope Cover Glass 50 x 24 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-544E Coverslips
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-550-15 Microscope Slides
Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL SP5 Confocal Microscope
Volocity x64 Software  Perkin Elmer, Waltham , MA version 4.4.0 Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing
Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software Bitplane, Concord, MA version 7.7.1 Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis
Excel Microsoft, Redmond, WA version Office 2013 Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features
Optimum Cutting Temperature Compound Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA 4583 abbreviated as OCT
Leica Cryostat Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL CM1850 Cryostat for cutting 50 µm sections
CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0 ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts C10600 Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nicholls, D. G., Budd, S. L. Mitochondria and neuronal survival. Physiol Rev. 80 (1), 315-360 (2000).
  2. Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Ann Rev Cell Dev Biol. 22, 79-99 (2006).
  3. Ni, H. M., Williams, J. A., Ding, W. X. Mitochondrial dynamics and mitochondrial quality control. Redox Biol. 4 (C), 6-13 (2015).
  4. Mink, J. W., Blumenschine, R. J., Adams, D. B. Ratio of central nervous system to body metabolism in vertebrates: its constancy and functional basis. Am J Physiol. 241 (3), R203-R212 (1981).
  5. Ames, A. CNS energy metabolism as related to function. Brain Res Brain Res Rev. 34 (1-2), 42-68 (2000).
  6. Harris, J. J., Jolivet, R., Attwell, D. Synaptic energy use and supply. Neuron. 75 (5), 762-777 (2012).
  7. Hollenbeck, P. J. The pattern and mechanism of mitochondrial transport in axons. Front Biosci. 1, d91-d102 (1996).
  8. Cai, Q., Sheng, Z. H. Mitochondrial transport and docking in axons. Exp Neurol. 218 (2), 257-267 (2009).
  9. Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (6), (2013).
  10. Saxton, W. M., Hollenbeck, P. J. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 125 (Pt 9), 2095-2104 (2012).
  11. Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biol. 11 (12), e1001754 (2013).
  12. Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of ranvier. J Neurosci. 31 (20), 7249-7258 (2011).
  13. Miller, K. E., Sheetz, M. P. Axonal mitochondrial transport and potential are correlated. J Cell Sci. 117, 2791-2804 (2004).
  14. Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61 (4), 541-555 (2009).
  15. Sheng, Z. H., Cai, Q. Mitochondrial transport in neurons: impact on synaptic homeostasis and neurodegeneration. Nat Rev Neurosci. 13 (2), 77-93 (2012).
  16. Berthold, C. H., Fabricius, C., Rydmark, M., Andersen, B. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. I. Occurrence and distribution in large myelinated spinal root axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 925-940 (1993).
  17. Fabricius, C., Berthold, C. H., Rydmark, M. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. II. Occurrence and distribution in large myelinated spinal cord axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 941-954 (1993).
  18. Hollenbeck, P. J., Saxton, W. M. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5411-5419 (2005).
  19. Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (27), 9953-9958 (2014).
  20. Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
  21. Chada, S. R., Hollenbeck, P. J. Nerve growth factor signaling regulates motility and docking of axonal mitochondria. Curr Biol. 14, 1272-1276 (2004).
  22. Yi, M., Weaver, D., Hajnoczky, G. Control of mitochondrial motility and distribution by the calcium signal: a homeostatic circuit. J Cell Biol. 167 (4), 661-672 (2004).
  23. Saotome, M., et al. Bidirectional Ca2+-dependent control of mitochondrial dynamics by the Miro GTPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20728-20733 (2008).
  24. Schon, E. A., Przedborski, S. Mitochondria: the next (neurode)generation. Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).
  25. Petrozzi, L., Ricci, G., Giglioli, N. J., Siciliano, G., Mancuso, M. Mitochondria and neurodegeneration. Biosci Rep. 27 (1-3), 87-104 (2007).
  26. Maresca, A., la Morgia, C., Caporali, L., Valentino, M. L., Carelli, V. The optic nerve: a "mito-window" on mitochondrial neurodegeneration. Mol Cell Neurosci. 55, 62-76 (2013).
  27. Su, B., et al. Abnormal mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 135-142 (2010).
  28. Vincent, A. M., et al. Mitochondrial biogenesis and fission in axons in cell culture and animal models of diabetic neuropathy. Acta Neuropathol. 120 (4), 477-489 (2010).
  29. Leinninger, G. M., et al. Mitochondria in DRG neurons undergo hyperglycemic mediated injury through Bim, Bax and the fission protein Drp1. Neurobiol Dis. 23, 11-22 (2006).
  30. Leinninger, G. M., Edwards, J. L., Lipshaw, M. J., Feldman, E. L. Mechanisms of disease: mitochondria as new therapeutic targets in diabetic neuropathy. Nat Clin Pract Neurol. 2, 620-628 (2006).
  31. Edwards, J. L., et al. Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons. Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).
  32. Fernyhough, P., Roy Chowdhury, S. K., Schmidt, R. E. Mitochondrial stress and the pathogenesis of diabetic neuropathy. Expert Rev Endocrinol Metab. 5 (1), 39-49 (2010).
  33. Schmidt, R. E., Green, K. G., Snipes, L. L., Feng, D. Neuritic dystrophy and neuronopathy in Akita (Ins2(Akita)) diabetic mouse sympathetic ganglia. Exp Neurol. 216 (1), 207-218 (2009).
  34. Penna, G., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
  35. Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
  36. Glas, U., Bahr, G. F. Quantitative study of mitochondria in rat liver. Dry mass, wet mass, volume, and concentration of solids. J Cell Biol. 29 (3), 507-523 (1966).
  37. Bertoni-Freddari, C., et al. Morphological plasticity of synaptic mitochondria during aging. Brain Research. 628 (1-2), 193-200 (1993).
  38. Kaasik, A., Safiulina, D., Zharkovsky, A., Veksler, V. Regulation of mitochondrial matrix volume. Am J Physiol. 292 (1), C157-C163 (2007).
  39. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Meth. 4 (7), 559-561 (2007).
  40. Park, J. Y., et al. Mitochondrial swelling and microtubule depolymerization are associated with energy depletion in axon degeneration. Neuroscience. 238, 258-269 (2013).
  41. Court, F. A., Coleman, M. P. Mitochondria as a central sensor for axonal degenerative stimuli. Trends Neurosci. 35 (6), 364-372 (2012).
  42. Baloh, R. H. Mitochondrial dynamics and peripheral neuropathy. Neuroscientist. 14 (1), 12-18 (2008).
  43. Chowdhury, S. K., Smith, D. R., Fernyhough, P. The role of aberrant mitochondrial bioenergetics in diabetic neuropathy. Neurobiol Dis. 51, 56-65 (2013).
  44. Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
  45. Lauria, G., et al. EFNS guidelines on the use of skin biopsy in the diagnosis of peripheral neuropathy. Eur J Neurol. 12 (10), 747-758 (2005).
  46. Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. Eur J Neurol. 17 (7), e944-e909 (2010).
  47. Umapathi, T., Tan, W. L., Tan, N. C. K., Chan, Y. H. Determinants of epidermal nerve fiber density in normal individuals. Muscle Nerve. 33 (6), 742-746 (2006).
  48. Lauria, G., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J Neurol Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
  49. Lauria, G., et al. Intraepidermal nerve fiber density at the distal leg: a worldwide normative reference study. J Peripher Nerv Syst. 15 (3), 202-207 (2010).
  50. Hamid, H. S., et al. Hyperglycemia- and neuropathy-induced changes in mitochondria within sensory nerves. Ann Clin Transl Neurol. 1 (10), 799-812 (2014).

Tags

3D ImagingMitochondriaIntraepidermal Nerve FibersFluorescence ImmunohistochemistryPGP9.5PDHSecondary AntibodiesSignal EnhancementEpidermal Nerve FibersNeurological Complications
check_url/53369?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Hamid, H. S., Hayes, J. M., Feldman, E. L., Lentz, S. I. Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers. J. Vis. Exp. (127), e53369, doi:10.3791/53369 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image