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Neuroscience

Imaging tridimensionale e l'analisi dei mitocondri all'interno di fibre nervose umane Intraepidermal

Published: September 29, 2017
doi:
10.3791/53369
, , ,
1University of Michigan Medical School, 2Department of Neurology,University of Michigan, 3Department of Internal Medicine,University of Michigan

Summary

Questo protocollo utilizza tecniche di imaging e l’analisi tridimensionali (3D) per visualizzare e quantificare i mitocondri del nervo specifico. Le tecniche sono applicabili ad altre situazioni in cui un segnale fluorescente viene utilizzato per isolare un sottoinsieme di dati da un altro segnale fluorescente.

Abstract

L’obiettivo del presente protocollo è quello di studiare i mitocondri all’interno di fibre nervose intraepidermiche. Pertanto, le tecniche di imaging e l’analisi 3D sono state sviluppate per isolare i mitocondri del nervo specifico e valutare le alterazioni indotte da malattia dei mitocondri nella parte distale dei nervi sensoriali. Il protocollo combina fluorescenza immunoistochimica, microscopia confocale e tecniche di analisi di immagine 3D per visualizzare e quantificare i mitocondri del nervo specifico. Parametri dettagliati sono definiti in tutto le procedure al fine di fornire un esempio concreto di come utilizzare queste tecniche per isolare i mitocondri del nervo specifico. Gli anticorpi sono stati utilizzati per etichettare il nervo e segnali mitocondriali all’interno di sezioni di tessuto di pelle punch biopsie, che è stata seguita dall’immunofluorescenza indiretta per visualizzare i nervi ed i mitocondri con un segnale fluorescente verde e rosso rispettivamente. Z-serie di immagini sono state acquisite con microscopia confocale e software per l’analisi 3D è stato utilizzato per elaborare e analizzare i segnali. Non è necessario seguire i parametri esatti descritti all’interno, ma è importante essere coerenti con quelle scelte durante la colorazione, la procedura di acquisizione e analisi. La forza di questo protocollo è che è applicabile a una vasta gamma di circostanze in cui viene utilizzato un segnale fluorescente per isolare altri segnali che altrimenti sarebbe impossibili studiare da soli.

Introduction

I mitocondri servono funzioni cellulari vitali che includono la produzione di energia cellulare, buffering di calcio e che regolano necrotico e apoptotica delle cellule morte1,2,3. Il sistema nervoso ha un alto tasso metabolico rispetto al corpo4 suggerendo che i neuroni generano un elevato grado di energia cellulare sotto forma di adenosina trifosfato (ATP) attraverso la respirazione mitocondriale. Un sacco di documenti di prova che funzioni neuronali sono dipendente da ATP5, soprattutto presso le sinapsi6. Pertanto, la distribuzione dei mitocondri all’interno dei neuroni è importante.

Negli ultimi 10 anni che un sacco di informazioni ha dimostrato che il traffico e l’ancoraggio dei mitocondri di un neurone è altamente regolamentati. Proteine motrici sono coinvolti nella distribuzione di mitocondri a specifici compartimenti cellulari in tutto il neurone. Traffico dei mitocondri è particolarmente importante perché neuroni proiettano assoni e dendriti lontano dal soma. Proteine motrici chinesina principalmente diretto anterogrado (lontano il soma) tratta dei mitocondri lungo i microtubuli mentre dineina proteine motore diretto motilità retrograda (verso il soma)7,8,9 , 10. ci sono segnali cellulari un potenziale di membrana mitocondriale e conduzione di impulso che influenzano la presenza e la direzione di traffico mitocondriale11,12,13.

Oltre a trasportare i mitocondri, ci sono proteine specializzate per localizzare i mitocondri a specifici compartimenti cellulari che hanno richieste di alta energia, come nodi di Ranvier e sinapsi8,14, 17. In realtà, la maggior parte dei mitocondri all’interno di assoni è non motili9,13,18. Proteine specializzate come i mitocondri di ancoraggio syntaphilin i microtubuli lungo gli assoni, mentre altre proteine di ancoraggio mitocondri al actina citoscheletrica19–21. Ioni come il calcio e fattori di crescita sono stati segnalati per supportare la cessazione della circolazione di mitocondri per localizzarli in regioni dove sono necessari21,22,23.

Presi insieme, il traffico e l’attracco dei mitocondri sono vitali per il corretto funzionamento dei neuroni. A sostegno di ciò, interruzioni nel traffico mitocondriale sono stato associato con parecchi termini neurologici compreso la malattia di Alzheimer, sclerosi laterale amiotrofica, malattia di Charcot-Marie-Tooth, malattia di Huntington, spastica ereditaria paraparesis e atrofia ottica15,24,25,26,27. Recenti studi hanno messo a fuoco su disfunzione mitocondriale e la patologia come un meccanismo potenziale per la neuropatia diabetica, la perdita sensitiva connessa con diabete28,29,30,31 ,32,33. L’ipotesi è che il diabete altera la distribuzione dei mitocondri all’interno delle proiezioni sensoriali del terminale nervoso cutaneo. Di conseguenza, una tecnica è stata sviluppata per visualizzare e quantificare i mitocondri all’interno le fibre nervose intraepidermiche (IENFs), la punta distale delle afferenze sensoriali del ganglio di radice dorsale. La tecnica combina fluorescenza immunoistochimica di specifici mitocondriali ed etichette di fibre nervose con microscopia confocale serie z acquisizione di segnali con software di analisi di immagine 3D potente per misurare la distribuzione del nervo specifico mitocondri da biopsie cutanee umane per raggiungere questo obiettivo.

Protocol

biopsie di pelle sono state ottenute da soggetti che sono stati reclutati da una rete di grandi cure primarie comunitario presso l’Università dello Utah Diabetes Center (Salt Lake City, UT). Questo studio è stato approvato dalla Università del Michigan Institutional Review Board e rispettato i principi della dichiarazione di Helsinki. Scritto il consenso informato è stato ottenuto da ciascun soggetto prima del test. 1. fluorescenza immunoistochimica preparare le biopsie…

Representative Results

Visualizzazione e quantificazione dei mitocondri all’interno di IENFs umano Fluorescenza immunoistochimica permette l’etichettatura simultanea di molteplici segnali entro le biopsie della pelle umana per visualizzare i nervi, i mitocondri e nuclei. Una piastra a 96 pozzetti è un modo pratico per organizzare i passaggi della procedura di esame immuno-istochimico. La figura 1 Mostra …

Discussion

Questo protocollo è progettato per isolare, quantificare e analizzare la dimensione e la distribuzione dei mitocondri nervose specifiche all’interno di IENFs in 3D da biopsie di pelle umana. Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo. Immunohistochemistry digalleggiante fluorescenza è stato progettato per macchiare ed analizzare i segnali multipli in ogni campione, offrendo una metodologia più versatile per ricerca esplorativa44,45. Questa procedura conse…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da NS061039 di istituti nazionali di salute sovvenzioni K08-01A2, il programma per la ricerca di neurologia & scoperta e r. Alfred Taubman Medical Research Institute presso l’Università del Michigan. Questo lavoro utilizzato la morfologia e il nucleo di analisi di immagine del Michigan diabete Research Center, finanziato da istituti nazionali di salute Grant 5P 90 DK-20572 dall’Istituto nazionale di diabete e digestivo e malattie renali. Gli autori vorrei ringraziare J. Robinson Singleton e r. Gordon Smith (Università dello Utah) per la loro generosa donazione di campioni di pelle umana.

Materials

2% Zamboni's Fixative Newcomer Supply, Middleton, WI  1459A 2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP399-4 To make up 1X PBS
Image-iT FX Signal Enhancer ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts I36933 enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding
Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal) Proteintech Group Inc. Rosemont, IL 14730-1-AP abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody
Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal) abcam, Cambridge, MA ab110333 abbreviated as PDH
Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11034 red-fluorescent conjugated secondaryantibody
Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11032 green-fluorescent conjugated secondaryantibody
Albumin, from Bovine Serum Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A7906-100 abbreviated as BSA
Triton X- 100 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T9284 abbreviated as TX-100
0.22 µm Filter EMD Millipore, Billerica
MA		 MILLEX GP SLGP 033NS 0.22 µm Millipore filter
Parafilm M Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 13-374-10 Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)
Non-calibrated Loop Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 22-032092 inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)
96-well Assay Plate Corning Incorporated, Corning, NY 3603 96-well flat bottom plate
Prolong Gold antifade reagent with DAPI ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts P-36931 DAPI staining of nuclei
Microscope Cover Glass 50 x 24 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-544E Coverslips
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-550-15 Microscope Slides
Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL SP5 Confocal Microscope
Volocity x64 Software  Perkin Elmer, Waltham , MA version 4.4.0 Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing
Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software Bitplane, Concord, MA version 7.7.1 Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis
Excel Microsoft, Redmond, WA version Office 2013 Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features
Optimum Cutting Temperature Compound Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA 4583 abbreviated as OCT
Leica Cryostat Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL CM1850 Cryostat for cutting 50 µm sections
CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0 ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts C10600 Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal
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Hamid, H. S., Hayes, J. M., Feldman, E. L., Lentz, S. I. Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers. J. Vis. Exp. (127), e53369, doi:10.3791/53369 (2017).
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