Misurare phagosome pH Raziometrico microscopia a fluorescenza

Summary

Il pH fagosomico influenza la maturazione dei fagosomi, la produzione di ossidanti, l'uccisione fagosomiale e la presentazione dell'antigene. Qui descriviamo un metodo raziometrico per misurare le variazioni di pH nel corso temporale e nel punto finale nei singoli fagosomi nei fagociti viventi utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Abstract

Fagocitosi è un processo fondamentale attraverso il quale le cellule immunitarie innate fagocitare batteri, cellule apoptotiche o altre particelle estranee al fine di uccidere o neutralizzare il materiale ingerito, o di presentarlo come antigeni e di avviare le risposte immunitarie adattive. Il pH di fagosomi è un parametro critico regolazione fissione o fusione con endomembrane e l'attivazione degli enzimi proteolitici, eventi che permettono al vacuolo fagocitosi di maturare in un organello degradativa. Inoltre, è richiesto di traslocazione H ⁺ per la produzione di elevati livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS), che sono essenziali per l'uccisione efficiente e segnalazione ad altri tessuti dell'ospite. Molti patogeni intracellulari sovvertono uccisione fagocitico limitando phagosomal acidificazione, sottolineando l'importanza del pH in phagosome biologia. Qui si descrive un metodo per misurare raziometrica phagosomal pH nei neutrofili con fluoresceina isotiocianato (FITC) -labeled zymosan come phagocytic targETS e live-cell imaging. Il saggio si basa sulle proprietà di fluorescenza di FITC, che si spegne da pH acido quando eccitato a 490 nm ma non quando eccitato a 440 nm, permettendo la quantificazione di un rapporto pH-dipendente, piuttosto che di fluorescenza assoluta, di un singolo colorante. Viene inoltre fornito un protocollo dettagliato per l'esecuzione in loco di calibrazione tintura e la conversione del rapporto di valori reali di pH. Single-dye metodi raziometriche sono generalmente considerati superiori a singola lunghezza d'onda o protocolli pseudo-raziometrico dual-dye, in quanto sono meno sensibili alle perturbazioni, come lo sbiancamento, concentrarsi modifiche, variazioni laser, e l'etichettatura irregolare, che distorcono il segnale misurato. Questo metodo può essere facilmente modificato per misurare il pH in altri tipi di cellule fagocitiche e zymosan può essere sostituita da qualsiasi altra particella contenente ammina, da perline inerti ai microrganismi viventi. Infine, questo metodo può essere adattato a fare uso di altre sonde fluorescenti sensibili a diversi intervalli di pH o altri phagosomattività al, rendendolo un protocollo generale per l'imaging funzionale di fagosomi.

Introduction

La fagocitosi, il processo attraverso il quale le cellule immunitarie innate inghiottono particelle di grandi dimensioni, si è evoluta dal meccanismo alimentare degli organismi unicellulari, e comporta il legame con un bersaglio, avvolgendolo con una membrana e pizzicando la membrana per formare un vacuolo all'interno del citosol chiamato fagosoma. Mentre la membrana fagosomiale è derivata dalla membrana plasmatica, lo smistamento attivo delle proteine e dei lipidi, così come la fusione con le endomembrane durante la formazione dei fagosomi, trasformano il fagosoma in un organello distinto all'interno della cellula con proprietà degradative che consentono l'uccisione,....

Protocol

Etica Dichiarazione: Tutte le manipolazioni sugli animali sono state eseguite in stretta conformità con le linee guida del Comitato delle Università di Ginevra Animal Research.

1. Preparazione di obiettivi fagocitiche

1. Aggiungere 20 mg di zimosan essiccata a 10 ml di fosfato sterile salina tamponata (PBS). Vortex e calore in un bagno di acqua bollente per 10 min. Raffreddare e centrifugare a 2000 xg per 5 min.
2. Rimuovere il surnatante, risospendere in 1 ml di PBS e ultrasuoni per 10 minuti in un bagno sonicatore acqua. Trasferire 500 microlitri di due provette da 1,5 ml. Centrifugare a 11.000 g per 5 min.

Results

Di seguito sono riportati i risultati rappresentativi per un esperimento in cui il pH phagosomal dei neutrofili topo primari isolati dal midollo osseo di wild-type o Hvcn1 ^{- / -} sono stati confrontati topi. Per un esperimento riuscito, è importante ottenere abbastanza fagosomi all'interno del campo visivo durante tutta la durata del film accelerato, evitando troppi fagosomi, che sarà poi essere più difficile segmento durante l'analisi delle immagini. La figura 1 mostra ese.......

Discussion

Sebbene più tempo rispetto metodi alternativi, come la spettroscopia e FACS, che impiegano una simile strategia di utilizzo di un colorante sensibile al pH accoppiato obiettivi ma misurano il pH medio di una popolazione di fagosomi, microscopia offre diversi vantaggi. Prima è che interno ed esterno vincolati, ma non interiorizzato, le particelle possono essere facilmente distinguibili, senza dover aggiungere altre sostanze chimiche, come trypan blu o di anticorpi, per placare o etichettare particelle esterne, rispettiva.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Zymosan A polvere	Sigma-Aldrich	Z4250	Esistono vari fornitori
Isotiocianato di fluoresceina	Sigma-Aldrich	F7250	Esistono vari fornitori Anticorpo
anti-zymosan (Zymosan A Bioparticles opsonizing reagent)	Life Technologies	Z2850	Sigma-Aldrich O6637 è un prodotto equivalente. In alternativa, il siero al 25% può essere utilizzato come reagente opsonante.
4-Aminobenzoic hydrazide (4-ABH)	Santa Cruz	sc-204107	Tossico, uso guanti, esistono vari fornitori
Difenileneodonio cloruro (DPI)	Sigma-Aldrich	D2926	Tossico, uso guanti, esistono vari fornitori
Concanamicina A (ConcA)	Sigma-Aldrich	27689	Tossico, uso guanti, esistono vari fornitori
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143	Tossico, uso guanti, vari fornitori esistono
Monensin	Enzo	ALX-380-026-G001	Tossico, uso guanti, vari fornitori esistono
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Life Technologies	14200-075	Tossico, uso guanti, vari fornitori esistono
Hank's balance salt solution	Life Technologies	14025092	Ringer's balanced salt solution o altri chiari tamponi fisiologici possono essere sostituito.
Carbonato di sodio (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S7795	Esistono vari fornitori
Acido 2-(N-Morpholino)etansolfonico (MES)	Sigma-Aldrich	M3671	Esistono diversi fornitori
Acido 4-(2-idrossietil)piperazina-1-etansolfonico (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375	Esistono vari fornitori
N-metil-D-glucamina (NMDG)	Sigma-Aldrich	M2004	Esistono diversi fornitori
Glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N&primo;,acido N&primo;-tetraacetico (EGTA)	Sigma-Aldrich	3777	Esistono vari fornitori
Tris(idrossimetil)amminometano (Tris)	Sigma-Aldrich	T1503	Esistono diversi fornitori
Cloruro di potassio (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333	Esistono vari fornitori
Cloruro di sodio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Esistono vari fornitori
Cloruro di magnesio (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266	Esistono vari fornitori
Etanolo assoluto (EtOH)	Sigma-Aldrich	2860	Esistono vari fornitori
Piastre di Petri da 35 mm con fondo in vetro (Fluorodish)	World Precision Instruments	FD35-100	Possono essere sostenute piastre o vetrini coprioggetti Ibidi µ-clear con camere di imaging appropriate
Bagno d'acqua sonicante	O. Kleiner AG		Al suo posto può essere utilizzato un sonicatore, esistono vari fornitori di strumenti
Heamocytometer	Marienfeld GmbH		Esistono vari fornitori
di strumentiMicroscopio a distanza larga per immagini dal vivo	Carl Zeiss AG		Esistono diversi fornitori di strumenti, ma il microscopio deve essere in grado di visualizzare rispettivamente l'eccitazione/emissione 440/535 e 490/535. Le configurazioni confocali a disco rotante con capacità di campo chiaro possono essere sostituite, ma lo zimosano tende ad andare fuori fuoco più spesso.
Pompa peristaltica (Dynamax RP-1)	Rainin		Esistono diversi fornitori di strumenti
pHmetro	Schott Gerate GmbH		Esistono vari fornitori di strumenti
Contatore manuale	Milian SA		Esistono vari fornitori di strumenti