Porphyromonas gingivalis als Modellorganismus für die Beurteilung der Interaktion von anaeroben Bakterien mit Wirtszellen
Summary
This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.
Abstract
Anaerobe Bakterien weit zahlenmäßig überlegen Aerobier in vielen menschlichen Nischen wie dem Darm, Mund und Vagina. Darüber hinaus sind anaerobe Infektionen häufig und oft indigener Herkunft. Die Fähigkeit einiger anaerobe Erreger an menschliche Zellen einzudringen gibt ihnen adaptive Maßnahmen zur angeborenen Immunität zu entfliehen sowie Wirtszelle Verhalten zu modulieren. Jedoch sicherzustellen, dass die anaeroben Bakterien sind im experimentellen Untersuchung der Ereignisse kann Herausforderungen mit sich bringen zu Hause sind. Porphyromonas gingivalis, ein Gram-negative anaerobe, ist in der Lage eine Vielzahl von eindringenden eukaryotischen Nicht-Fresszellen. Dieser Artikel beschreibt, wie man erfolgreich Kultur und Beurteilung der Fähigkeit von P. gingivalis die menschliche Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) einzudringen. Zwei Protokolle wurden entwickelt: ein, um Bakterien, die erfolgreich eindringen kann und zu überleben, in dem Wirt, und der andere, um Bakterien Interaktion mit Wirtszellen sichtbar zu messen. Diese Techniken erfordern die Verwendung eines anaeRobic Kammer P. liefern gingivalis mit einer anaeroben Umgebung für ein optimales Wachstum.
Das erste Protokoll ist auf der antibiotischen Schutz-Assay, die weitgehend verwendet wird, um die Invasion von Wirtszellen, die durch Bakterien Studie. Jedoch ist die Antibiotikum-Schutzassay beschränkt; nur intrazelluläre Bakterien, die nach Behandlung mit Antibiotika und Host-Zell-Lyse kultivierbar sind, werden gemessen. Um alle Bakterien, die Interaktion mit Wirtszellen, sowohl lebenden und toten beurteilen wir ein Protokoll, das Fluoreszenz-Mikroskopie verwendet, um Wirt-Pathogen-Interaktion untersuchen entwickelt. Bakterien fluoreszent mit 2 'bezeichnet, 7'-Bis- (2-Carboxyethyl) -5- (und-6) -carboxyfluorescein-acetoxymethylester (BCECF-AM) und verwendet, um eukaryotische Zellen unter anaeroben Bedingungen zu infizieren. Folgende Fixierung mit Paraformaldehyd und Permeabilisierung mit 0,2% Triton X-100, werden Wirtszellen mit TRITC-Phalloidin und DAPI markiert, um den Zellkern und Cytoskelett beschriften sind. Mehrere images zu verschiedenen Schwerpunkten (Z-Stack) getroffen werden für zeitlich-räumliche Visualisierung von Bakterien erhalten. Verfahren in dieser Studie verwendet wird, kann auf jede kultivierbare anaerobe und jegliche eukaryotische Zelltyp angewendet werden.
Introduction
Anaerobe Bakterien besiedeln fast alle Oberflächen des menschlichen Körpers. Obwohl überwiegend in der Flora des Darm und Urogenitaltrakts, wo Sauerstoffkonzentrationen sind niedrig, es gibt sie auch in hohen Konzentrationen auf der Haut, Mund, Nase und Rachen 1. Anaerobe Bakterien sind eine häufige Ursache von endogenen Infektionen und werden häufig von erkrankten Stellen isoliert. Jedoch aufgrund ihrer Natur anspruchsvolle Anaerobier können schwierig zu isolieren und Kultur. Studien mit anaeroben Bakterien sind unter eingeschränkten Bedingungen durchgeführt werden. Moderne anaeroben Kulturtechniken es den Forschern ermöglichen, um die anaerobe Einstellungen erforderlich, um viele anaerobe Laborstämmen oder klinischen Isolaten 2,3 studieren zu imitieren.
Pathogenen anaeroben Bakterien haben eine dynamische Beziehung und Co-Evolution mit den Wirtszellen in dem sie wohnen entwickelt. Esten Anaerobier sind anfällig für das Töten von der Immunantwort des Wirts vor Erreichen infectischiedenen Ebenen. Allerdings haben einige pathogene Bakterien Mechanismen zu entkommen oder untergraben die Wirtsimmunantwort entwickelt. Sie erreichen dieses Ziel durch Mechanismen wie Umgehung der Immunerkennung, Neutralisation von Immunmediatoren, Veränderung der zellvermittelten Immunität, Invasion von Wirtszellen und Veränderung der Immunsignal 4. Porphyromonas gingivalis, eine Gram-negative anaerobe sowohl mündlich als auch in Verbindung gebracht extraoralen Erkrankungen, ist ein Beispiel eines hoch angepasst bakterielles Pathogen Lage verursacht pathogenen Veränderungen im Aufnahme 5-7.
Taschen der Biofilm Plaque in tiefen Spalten zwischen den Zähnen und Zahnfleischschleimhautgewebe gebildeten anaeroben Bakterien, die von Luftsauerstoff 8 geschützten Hafen abgegrenzt. Diese Zahnfleischtaschen dienen als Nische für verschiedene anaerobe Erreger wie P. gingivalis 9. P. gingivalis ist eine Keystone-Erreger, der in der Lage ist, umgestaltening die mündliche mikrobiellen Gemeinschaft in einer Weise, die Entwicklung und Progression von Parodontalerkrankungen 10 zu fördern. Es erzeugt eine große Anzahl von Virulenzfaktoren, die aktiv sind gegen ein breites Spektrum von Wirtsproteinen und stellt Mechanismen für die Umgehung der Wirtsabwehr 11. Es ist auch in der Lage eindringenden Epithelzellen, Endothelzellen, Fibroblasten und Parodontalligament Zellen in vitro und di vivo-12-14 15. Durch die effiziente Invasion von Wirtszellen, P. gingivalis kann Wirtsimmunität zu entkommen. Effektive Invasion von Wirtszellen ermöglicht nicht nur das Bakterium, um Wirtsabwehr zu entkommen, sondern dient auch als Reservoir für künftige Re-Infektion als auch verändert die Wirtszelle. Untersuchungen der molekularen Mechanismen der Adhäsion und Internalisierung des Bakteriums durch Wirtszellen beteiligt sind, erforderlich ist. Forschung in mehreren Laboratorien wird auf das Verständnis der molekularen Vorgänge bei der Internalisierung von P. assoziiert konzentriert gingivalis durch die Wirtszellensowie die verwendet werden, um zu unterdrücken und zu entführen, die Immunantwort und zu überleben, die feindlichen Abwehrmechanismen Mechanismen.
Es gibt viele Tests, die die Identifizierung und Charakterisierung von Krankheitserregern, die in der Lage ist eindringenden Wirtszellen sind. In vitro-Studien mit anaerobe Pathogene Jedoch stellen viele experimentelle Probleme für die Forscher vor allem, weil es schwierig ist, Untersuchungen mit sperrigen Instrumente in Abwesenheit von Sauerstoff zu bauen. Dies wird durch die Tatsache, dass eukaryotische Zellen benötigen Sauerstoff, zu wachsen und müssen somit separat in Gewebekultur-Inkubatoren hergestellt werden verstärkt. Ein Weg, um solche Hindernisse zu vermeiden, wäre es, die Untersuchungen unter atmosphärischem Sauerstoff durchzuführen, aber das würde das Wachstum von anaeroben Bakterien unmöglich machen. Ein weiteres Verfahren wäre die durch Wärme abgetöteten Bakterien zu verwenden, um zu infizieren und zu studieren Host-Zell-Interaktionen. Zwischen Hitze abgetöteten und lebensfähigen Bakterien, die die Relevanz der Wirt-Pathogen interacti verringern bestehen jedoch Unterschiedeam 16. Es ist von zentraler Bedeutung für lebensfähige Bakterien mit unveränderter Expression Interaktion mit Wirtszellen zu studieren; Daher sind Verfahren zur Züchtung von P. gingivalis in einer anaeroben Umgebung gegeben. Auch sind zwei einfache kosteneffektive Protokolle zur Bewertung der Fähigkeit von P. zeigten gingivalis durch menschliche Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) internalisiert werden. Das erste Protokoll basiert auf dem beliebten Antibiotikum-Schutz-Assay basiert. Obwohl der Test ist einfach, sind Überlegungen bei der Verwendung von anaeroben Mikroorganismen gegeben. Das zweite Protokoll erfordert die Verwendung eines fluoreszierenden Scanning-Mikroskop zur Visualisierung Interaktion und verinnerlicht P. gingivalis. Jeder Test hat seine Grenzen und Vorteile, die diskutiert werden, den Forscher eine Gliederung für die Untersuchung der Invasivität von anaeroben Bakterien bereitzustellen. Obwohl die aktuelle Manuskript studiert P. gingivalis und HUVECs können diese Protokolle für viele andere anaerobe Bakterien ebenso verwendet werdenwie für andere Arten von Wirtszellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Alle oben genannten Verfahren können verwendet werden, um spezifische Assays, um die Wechselwirkung von anaeroben Bakterien mit eukaryotischen Zellen beurteilen zu entwerfen. Jedoch gibt es einige Überlegungen, die Versuche erfolgreich durchzuführen. Zuerst gibt es die Mikrobenstämme in einer Studie verwendet werden.
Es ist von entscheidender Bedeutung bei dem Vergleich von zwei Stämmen sowohl mit dem Überlebens-Assay sowie durch Mikroskopie-Analyse, daß sie sich in einer ähnlichen W…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Hiroshi Miyazaki, Dr. Scott Henderson, Dr. Todd Kitten, Dr. Justin Hutcherson, Dr. Catherine Jauregui, and Collin R. Berry. This work was supported by NIH NIDCR grants R01DE016124, R01DE018039, and R01DE023304 to J.P. Lewis.
Microscopy was performed at the VCU Department of Anatomy and Neurobiology Microscopy Facility, supported, in part, with funding from NIH-NINDS Center core grant (5P30NS047463).
Materials
| Vinyl Anaerobic Chamber-Type B | Coy Laboratory Products | Model 2000 incubator | |
| TSA II Trypticase Soy Agar w/5% Sheep Blood | BBL | 221261 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool | LifeLine Technology | FC-0044 | |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | LifeLine Technology | LL-0003 | |
| TrypKit | LifeLine | LL-0013 | |
| Saponin | Riedel-de Haen | 16109 | |
| Gentamicin Sulfate Salt | Sigma-Aldrich | G-1264 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich | M-3761 | |
| BCECF-AM | LifeTechnologies | B1150 | |
| TRITC Phalloidin | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 18 mm Circular Coverslips | Electron Microscopy Sciences | 72222-01 | |
| VectaShield Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
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