Porphyromonas gingivalis como um organismo modelo para a Avaliação da Interação de bactérias anaeróbias com células do hospedeiro

Summary

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Abstract

As bactérias anaeróbicas longe superam os aeróbios em muitos nichos humanos, tais como o intestino, boca e vagina. Além disso, infecções anaeróbias são comuns e frequentemente de origem indígena. A capacidade de alguns agentes patogénicos anaeróbios de invadir células humanas lhes dá as medidas de adaptação para escapar imunidade inata, bem como para modular o comportamento da célula hospedeira. No entanto, assegurar que as bactérias anaeróbias são vivo durante a investigação experimental dos eventos pode representar desafios. Porphyromonas gingivalis, um anaeróbio Gram-negativos, é capaz de invadir uma variedade de células não fagocíticas eucarióticas. Este artigo descreve como para com êxito a cultura e avaliar a capacidade do P. gingivalis de invadir células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs). Dois protocolos foram desenvolvidos: um para medir as bactérias que podem invadir e sobreviver com sucesso dentro do hospedeiro, e a outra para visualizar as bactérias que interagem com as células hospedeiras. Estas técnicas requerem a utilização de um anaecâmara para fornecer P. Robic gingivalis com um ambiente anaeróbico para o crescimento ideal.

O primeiro protocolo baseia-se no ensaio de protecção de antibiótico, que é largamente utilizada para estudar a invasão das células hospedeiras por bactérias. No entanto, o ensaio de protecção de antibiótico é limitada; apenas bactérias intracelulares que são cultiváveis ​​após o tratamento antibiótico e a lise da célula hospedeira são medidos. Para avaliar todas as bactérias interagem com células hospedeiras, tanto vivos e mortos, desenvolvemos um protocolo que utiliza a microscopia fluorescente para examinar interação patógeno-hospedeiro. As bactérias são marcado por fluorescência com 2 ', 7'-bis- (2-carboxietil) -5- (e-6) -carboxyfluorescein acetoximetil éster (BCECF-AM) e utilizados para infectar células eucarióticas em condições anaeróbias. Após fixação com paraformaldeído e permeabilização com 0,2% de Triton X-100, as células hospedeiras são marcados com TRITC-faloidina e DAPI para marcar o citoesqueleto da célula e do núcleo, respectivamente. Multiple images tomadas em diferentes pontos focais (Z-stack) são obtidos para visualização temporal e espacial das bactérias. Os métodos usados ​​neste estudo pode ser aplicada a qualquer bactéria anaeróbia cultiváveis ​​e qualquer tipo de célula eucariótica.

Introduction

As bactérias anaeróbicas colonizar quase todas as superfícies do corpo humano. Embora predominante na flora do trato intestinal e genito-urinário, onde as concentrações de oxigênio são baixos, eles também existem em níveis elevados na pele, boca, nariz e garganta ^1. As bactérias anaeróbicas são uma causa comum de infecções endógenas e frequentemente são isoladas de sítios doentes. No entanto, devido à sua natureza fastidiosa, anaeróbios podem ser difíceis de isolar e cultivar. Estudos envolvendo bactérias anaeróbias deve ser feito sob condições restritas. Técnicas anaeróbio-cultura moderna permitem aos pesquisadores para imitar as configurações anaeróbias necessárias para estudar muitas cepas laboratoriais anaeróbia ou mesmo isolados clínicos ^2,3.

Bactérias anaeróbicas patogénicas têm desenvolvido uma relação dinâmica e co-evolução com as células hospedeiras em que residem. A maioria dos anaeróbios são susceptíveis à morte pela resposta imunitária do hospedeiro antes de atingir infectiníveis OUs. No entanto, algumas bactérias patogénicas desenvolveram mecanismos para escapar ou subverter a resposta imune do hospedeiro. Eles alcançar este objetivo através de mecanismos como a evasão de reconhecimento imunológico, neutralização de mediadores do sistema imunológico, alteração de imunidade mediada por células, invasão de células hospedeiras, e alteração da imunológico sinalizando ^4. Porphyromonas gingivalis, uma bactéria anaeróbia Gram-negativo implicado em ambos oral e doenças extra-orais, é um exemplo de um agente patogénico bacteriano altamente adaptado capaz de causar alterações patogénicas no hospedeiro ^5-7.

Bolsões de biofilme placa acumulado em fendas profundas formadas entre os dentes e tecido da mucosa gengival pode abrigar bactérias anaeróbias que são protegidos de oxigênio atmosférico ^8. Estas bolsas periodontais servir como um nicho para vários patógenos anaeróbicos, como P. gingivalis ^9. P. gingivalis é um agente patogénico da distorção que é capaz de remodelaçãoing a comunidade microbiana oral, de forma a promover o desenvolvimento e progressão de doenças periodontais ^10. Ela produz um grande número de fatores de virulência que são ativos contra um amplo espectro de proteínas do hospedeiro e fornece mecanismos para a evasão de defesas do hospedeiro ^11. É também capaz de invadir epiteliais, endoteliais, fibroblastos e células do ligamento periodontal in vitro e in vivo ^{12-14 15.} Por eficazmente invadir as células hospedeiras, P. gingivalis pode escapar imunidade do hospedeiro. Invasão efectiva de células hospedeiras não só permite que a bactéria de escapar defesas do hospedeiro, mas também serve como um reservatório para o futuro re-infecção, bem como a célula hospedeira altera. São necessários estudos dos mecanismos moleculares envolvidos na adesão e internalização da bactéria por células hospedeiras. Pesquisa em vários laboratórios está focada na compreensão dos eventos moleculares associados com a internalização de P. gingivalis pelas células hospedeirasbem como os mecanismos utilizados para suprimir e sequestrar a resposta imune e sobreviver a mecanismos de defesa do hospedeiro hostis.

Existem muitos ensaios capazes de identificar e caracterizar agentes patogénicos que são capazes de invadir as células hospedeiras. No entanto, estudos in vitro com agentes patogénicos anaeróbios apresentam muitos problemas experimentais para o investigador, principalmente porque é difícil realizar estudos que dependem de instrumentos volumosos, na ausência de oxigénio. Esta situação é agravada pelo fato de que as células eucarióticas necessitam de oxigênio para crescer e, portanto, deve ser preparado separadamente em incubadoras de cultura de tecidos. Uma maneira de evitar tais obstáculos seria realizar os estudos sob o oxigénio atmosférico, mas que iria tornar o crescimento de bactérias anaeróbicas impossível. Outro método seria a utilização de bactérias mortas por calor para infectar e estudar interacções célula-hospedeiro. No entanto, existem diferenças entre as bactérias mortas pelo calor e viáveis ​​que diminuem a relevância do interacti patógeno-hospedeiro^no dia 16. Ele é central para estudar bactérias viáveis ​​com expressão inalterada interagindo com células hospedeiras; Assim, os métodos para a cultura de P. gingivalis em um ambiente anaeróbico são dadas. Além disso, dois protocolos de baixo custo simples são demonstrados para avaliar a capacidade do P. gingivalis para ser internalizada pelas células endoteliais humanas da veia umbilical (HUVEC). O primeiro protocolo baseia-se no ensaio de protecção de antibiótico populares. Embora o ensaio é simples, as considerações ao usar microrganismos anaeróbios são dadas. O segundo protocolo requer a utilização de um microscópio de varrimento de fluorescência para visualizar a interagir e internalizado P. gingivalis. Cada ensaio tem as suas limitações e vantagens que serão discutidos para fornecer o pesquisador um esboço para estudar a invasão de bactérias anaeróbicas. Embora o manuscrito atual estuda P. gingivalis e HUVEC, estes protocolos podem ser utilizados para muitos outros tipos de bactérias anaeróbicas, bemcomo para outros tipos de células hospedeiras.

Protocol

Os seguintes protocolos vai descrever métodos para a cultura e estudar a invasão pelas espécies anaeróbicas, P. gingivalis; No entanto, estes protocolos podem ser utilizados para uma série de agentes patogénicos anaeróbios. Embora HUVECs são usados, este protocolo pode ser usado para outras células eucarióticas tanto imunes e não-imunes. 1. Anaerobic Chamber Uso e Manutenção Nota: P. gingivalis é um anaeróbio sensível aos …

Representative Results

Protocolos descritas acima foram usadas no estudo de interação patógeno-hospedeiro entre P. gingivalis e células endoteliais. P. gingivalis W83 e um P. gingivalis V3150 transportando uma deleção de PG0228 foram utilizados no estudo. O PG0228 está previsto para codificar uma proteína que podem alterar os níveis de RNA e proteínas, o que pode em última análise afectar a interacção de P. gingivalis com células hospedeiras. Para investigar o efeito da PG0228 em <em…

Discussion

Todos os métodos acima podem ser utilizados para conceber ensaios específicas para avaliar a interacção de bactérias anaeróbicas com células eucarióticas. No entanto, há várias considerações para realizar com sucesso experiências. Primeiro são as estirpes microbianas para ser utilizados num estudo.

É crucial para a comparação de duas estirpes com ambos o ensaio de sobrevivência, bem como por análise de microscopia de que eles estão em fases de crescimento semelhantes e at…

Materials

Vinyl Anaerobic Chamber-Type B	Coy Laboratory Products		Model 2000 incubator
TSA II Trypticase Soy Agar w/5% Sheep Blood	BBL	221261
Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool	LifeLine Technology	FC-0044
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	LifeLine Technology	LL-0003
TrypKit	LifeLine	LL-0013
Saponin	Riedel-de Haen	16109
Gentamicin Sulfate Salt	Sigma-Aldrich	G-1264
Metronidazole	Sigma-Aldrich	M-3761
BCECF-AM	LifeTechnologies	B1150
TRITC Phalloidin	Sigma-Aldrich	P1951
18 mm Circular Coverslips	Electron Microscopy Sciences	72222-01
VectaShield Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200