숙주 세포와 혐기성 세균의 상호 작용을 평가하기위한 모델 생물로 포피 진지 발리
Summary
This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.
Abstract
혐기성 박테리아는 지금까지와 같은 창자, 입 및 질만큼 인간의 틈새에서 성균보다 많다. 또한, 혐기성 감염은 일반적이고 자주 원주민 출신이다. 인간의 세포에 침입하는 일부 혐기성 병원균의 능력은 그들에게 선천성 면역을 탈출뿐만 아니라 숙주 세포의 행동을 조절하는 적응 대책을 제공합니다. 그러나, 혐기성 세균이 문제를 일으킬 수 사건 조사 실험 도중 라이브임을 보장. 포피로 모나스 진지의, 그램 음성 혐기성는 진핵 비 식세포 다양한 침입 할 수있다. 이 문서에서는 성공적으로 문화와는 P.의 능력을 평가하는 방법에 대해 설명합니다 진지 발리는 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs를)을 침공. 두 개의 프로토콜이 개발되었다 : 하나는 성공적 침입 숙주 내에서 생존 및 다른 숙주 세포와 상호 작용하는 박테리아를 시각화 할 수있는 박테리아를 측정하기 위해. 이러한 기술은 처남의 사용을 필요robic P. 공급 챔버 최적 성장 혐기성 환경 진지 발리.
제 1 프로토콜은 주로 박테리아 숙주 세포의 침윤을 연구하는 데 사용되는 항생제 보호 분석에 기초한다. 그러나, 항생제 보호 분석법은 제한된다; 항생제 치료 및 숙주 세포 용해 다음 배양 세포 내 박테리아 만이 측정된다. 살아있는 및 죽은 모두 숙주 세포와 상호 작용하는 모든 세균을 평가하기 위해, 우리는 호스트 병원체 상호 작용을 조사하기 위해 형광 현미경을 사용하는 프로토콜을 개발했다. 박테리아 형광, 2 '와 7'- 비스 – (2- 카르복시 에틸)에 표시되어 -5- (및 -6) -carboxyfluorescein 아세 톡시 메틸 에스터 (BCECF-AM) 및 혐기성 조건 하에서 진핵 세포를 감염시키기 위해 사용된다. 0.2 % 트리톤 X-100과 파라 포름 알데히드 및 투과성으로 함께 고정 다음, 숙주 세포는 각각 세포 골격과 핵 라벨을 TRITC의 팔로이 딘 및 DAPI로 라벨링된다. 여러 IMA다른 초점 (Z-스택)에서 촬영 GES는 박테리아의 시간적 공간적 시각화를 얻을 수있다. 이 연구에서 사용되는 방법은 경작 혐기성 및 진핵 세포 유형에 적용될 수있다.
Introduction
혐기성 박테리아는 인체의 거의 모든 표면에 정착. 산소 농도가 낮은 장과 비뇨 생식기 책자의 식물에서 우세하지만, 그들은 또한 피부, 입, 코, 목의 1에 높은 수준으로 존재한다. 혐기성 박테리아는 내인성 감염의 흔한 원인이며, 자주 병에 걸린 사이트에서 격리됩니다. 그러나, 그들의 까다로운 성격, 혐기성 격리하고 문화 어려울 수 있습니다. 혐기성 박테리아를 포함하는 연구는 제한된 조건에서 수행해야합니다. 현대 혐기성 배양 기술은 연구자가 많은 혐기성 실험 균주 또는 임상 분리 2,3을 연구하는 데 필요한 혐기성 설정을 모방 할 수 있습니다.
병원성 혐기성 세균들이 거주하는 숙주 세포와 동적 관계 공진화를 개발했다. 대부분의 혐기성는 infecti에 도달하기 전에 호스트 면역 반응에 의해 살해에 민감하다OU에 수준. 그러나 일부 병원성 박테리아로부터 탈출 또는 숙주 면역 반응을 파괴하는기구를 개발했다. 그들은 이러한 면역 인식, 면역 매개 물질의 중화, 세포 매개 면역의 변경, 숙주 세포의 침윤, 4 신호 면역의 변경의 회피로 메커니즘을 통해이 목표를 달성. 포피 gingivalis에 모두 구강과에 연루 그람 음성 혐기성를 구외 질환, 호스트 5-7 병원성 변화를 일으킬 수있는 매우 적합 세균성 병원체의 일례이다.
생물막 플라크의 포켓은 대기 산소 (8)로부터 보호되는 혐기성 박테리아를 정박 할 수있는 치아와 치은 점막 조직 사이에 형성된 깊은 틈새에서 발생한. 이러한 치주 포켓은 피 등 다양한 혐기성 병원균에 대한 틈새 시장의 역할 진지 발리 (9). P. 진지 발리는 리모델링 할 수있는 키스톤 병원균이다치주 질환 (10)의 발생과 진행을 촉진 방법으로 구강 미생물 커뮤니티를 보내고. 이는 호스트 단백질의 광범위한 스펙트럼에 대해 활성 및 숙주 방어 11 회피 메커니즘을 제공 독성 인자의 대량 생산. 또한, 시험 관내 및 생체 내 12-14 15 상피, 내피, 섬유 아세포, 및 치주 인대 세포에 침입 할 수있다. 효과적으로 피를 숙주 세포에 침입하여 진지 발리는 호스트 면역을 탈출 할 수 있습니다. 숙주 세포의 효과적인 침략뿐만 아니라 박테리아가 숙주 방어를 탈출 할 수 있습니다뿐만 아니라 미래에 다시 감염에 대한 저수지 역할뿐만 아니라 숙주 세포를 변경합니다. 숙주 세포에 의해 부착 및 세균 내면화에 관여하는 분자 메커니즘의 연구가 필요하다. 여러 실험실에서 연구 P.의 국제화와 관련된 분자 이벤트를 이해에 초점을 맞추고 숙주 세포에 의해 진지 발리뿐만 아니라 억제하고 면역 반응을 납치하고 적대적인 호스트 방어 메커니즘을 생존하는 데 사용되는 메커니즘으로.
식별 및 숙주 세포에 침입 할 수있는 병원체의 특성을 분석 할 수있는 많은있다. 이 산소없이 부피 악기에 의존 연구를 수행하는 것은 곤란하다 때문에, 혐기성 병원균 관내 연구는 주로 많은 실험적 연구 문제를 제기. 이는 진핵 세포 성장에 산소를 필요로하며, 따라서 조직 배양 인큐베이터에서 별도로 준비되어야한다는 사실에 의해 복잡해진다. 그러한 장애물을 피할 수있는 한 가지 방법은 산소 분위기 하에서 조사를 수행하는 것,하지만 혐기성 박테리아의 성장이 불가능하게된다. 또 다른 방법은 감염 숙주 세포의 상호 작용을 연구하기 위해 열 살해 박테리아를 사용하는 것이다. 그러나 차이는 호스트 병원체 interacti의 관련성을 감소 열 명이 사망하고 실행 가능한 박테리아 사이에 존재16. 그것은 숙주 세포와의 상호 작용 변경되지 않은 표현으로 가능한 박테리아를 연구하는 중심; 피를 배양 따라서 방법 혐기성 환경에서 진지 발리가 제공됩니다. 또한, 간단한 두 비용 효율적인 프로토콜 P.의 능력을 평가하기위한 입증되고 진지 발리는 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs를)에 의해 내면화한다. 제 1 프로토콜은 인기 항생제 보호 분석에 기초한다. 분석이 간단하지만, 혐기성 미생물을 이용한 고려 주어진다. 제 2 프로토콜은 상호 작용 시각화 형광 주사 현미경의 사용을 필요로하며, P. 내재화 진지 발리. 각 분석은 한계 및 혐기성 세균의 침입을 연구 연구자에게 개요를 제공하도록 설명되는 장점을 갖는다. 현재 원고는 피를 연구했지만 HUVECs를 진지 발리 및 이러한 프로토콜뿐만 아니라 다른 많은 혐기성 세균에 대해 사용될 수있다숙주 세포의 다른 유형에도.
Protocol
Representative Results
Discussion
위의 모든 방법들은 진핵 세포와 혐기성 세균의 상호 작용을 평가하기위한 특정 분석법을 설계하는데 사용될 수있다. 그러나 성공적으로 실험을 수행 할 수있는 몇 가지 고려 사항이 있습니다. 먼저 실험에 사용되는 균주이다.
그것은 그들이 유사한 성장 단계에 있으며 침입 효율 (13)에 영향을 미칠 수있는 전술의 차이와 유사한 세포 농도를 달성한다는 생존 분석 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Hiroshi Miyazaki, Dr. Scott Henderson, Dr. Todd Kitten, Dr. Justin Hutcherson, Dr. Catherine Jauregui, and Collin R. Berry. This work was supported by NIH NIDCR grants R01DE016124, R01DE018039, and R01DE023304 to J.P. Lewis.
Microscopy was performed at the VCU Department of Anatomy and Neurobiology Microscopy Facility, supported, in part, with funding from NIH-NINDS Center core grant (5P30NS047463).
Materials
| Vinyl Anaerobic Chamber-Type B | Coy Laboratory Products | Model 2000 incubator | |
| TSA II Trypticase Soy Agar w/5% Sheep Blood | BBL | 221261 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool | LifeLine Technology | FC-0044 | |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | LifeLine Technology | LL-0003 | |
| TrypKit | LifeLine | LL-0013 | |
| Saponin | Riedel-de Haen | 16109 | |
| Gentamicin Sulfate Salt | Sigma-Aldrich | G-1264 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich | M-3761 | |
| BCECF-AM | LifeTechnologies | B1150 | |
| TRITC Phalloidin | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 18 mm Circular Coverslips | Electron Microscopy Sciences | 72222-01 | |
| VectaShield Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
Riferimenti
- Hentges, D. J. The Anaerobic Microflora of the Human Body. Clin. Infect. Dis. 16 (4), S175-S180 (1993).
- Willis, A. T. . Anaerobic bacteriology: clinical and laboratory practice. , (2014).
- Wren, M. W., Baldwin, A. W., Eldon, C. P., Sanderson, P. J. The anaerobic culture of clinical specimens: a 14-month study. J. Med. Microbiol. 10 (1), 49-61 (1977).
- Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41 (3), 188-202 (2008).
- Mayrand, D., Holt, S. C. Biology of asaccharolytic black-pigmented Bacteroides species. Microbiol. Rev. 52 (1), 134-152 (1988).
- Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. Life below the gum line: pathogenic mechanisms of Porphyromonas gingivalis. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (4), 1244-1263 (1998).
- Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Microbial etiological agents of destructive periodontal diseases. Periodontol. 2000. 5 (1), 78-111 (1994).
- Listgarten, M. A. Structure of the microbial flora associated with periodontal health and disease in man. A light and electron microscopic study. J. Periodontol. 47 (1), 1-18 (1976).
- Ximénez-Fyvie, L. A., Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Comparison of the microbiota of supra- and subgingival plaque in health and periodontitis. J. Clin. Periodontol. 27 (9), 648-657 (2000).
- Darveau, R. P., Hajishengallis, G., Curtis, M. A. Porphyromonas gingivalis as a potential community activist for disease. J. Dent. Res. 91 (9), 816-820 (2012).
- Holt, S. C., Kesavalu, L., Walker, S., Genco, C. A. Virulence factors of Porphyromonas gingivalis. Periodontol. 2000. 20 (1), 168-238 (1999).
- Lamont, R. J., Yilmaz, &. #. 2. 4. 6. ;. Z. In or out: the invasiveness of oral bacteria. Periodontol. 2000. 30 (1), 61-69 (2002).
- Lamont, R. J., et al. Porphyromonas gingivalis invasion of gingival epithelial cells. Infect. Immun. 63 (10), 3878-3885 (1995).
- Belton, C. M., Izutsu, K. T., Goodwin, P. C., Park, Y., Lamont, R. J. Fluorescence image analysis of the association between Porphyromonas gingivalis and gingival epithelial cells. Cell. Microbiol. 1 (3), 215-223 (1999).
- Rautemaa, R., et al. Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients. Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).
- Kaufmann, S. H. Immunity to intracellular bacteria. Annu. Rev. Immunol. 11 (1), 129-163 (1993).
- Diaz, P., Rogers, A. The effect of oxygen on the growth and physiology of Porphyromonas gingivalis. Oral Microbiol. Immunol. 19 (2), 88-94 (2004).
- Lewis, J. P., Iyer, D., Anaya-Bergman, C. Adaptation of Porphyromonas gingivalis to microaerophilic conditions involves increased consumption of formate and reduced utilization of lactate. Microbiology. 155, 3758-3774 (2009).
- Edwards, A. N., Suarez, J. M., McBride, S. M. Culturing and maintaining Clostridium difficile in an anaerobic environment. J. Vis. Exp. (79), e50787 (2013).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. , (2001).
- Koch, A. L., Crandall, M. Photometric measurement of bacterial growth. The American Biology Teacher. 30 (6), 481-485 (1968).
- Wikins, T. D., Holdeman, L. V., Abramson, I. J., Moore, W. E. Standardized single-disc method for antibiotic susceptibility testing of anaerobic bacteria Antimicrob. Agents Chemother. 1 (6), 451-459 (1972).
- Bauer, A. W., Kirby, W. M., Sherris, J. C., Turck, M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 45 (4), 493-496 (1966).
- Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. J. Clin. Invest. 52 (7), 1673-1679 (1973).
- Menzies, B. E., Kourteva, I. Internalization of Staphylococcus aureus by endothelial cells induces apoptosis. Infect. Immun. 66 (12), 5994-5998 (1998).
- Naito, M., et al. Determination of the genome sequence of Porphyromonas gingivalis strain ATCC 33277 and genomic comparison with strain W83 revealed extensive genome rearrangements in P. gingivalis. DNA Res. 15 (4), 215-225 (2008).
- Goebel, W., Kuhn, M. Bacterial replication in the host cell cytosol. Curr. Opin. Microbiol. 3 (1), 49-53 (2000).
- Gospodarowicz, D. C. Extracellular matrix and control of proliferation of vascular endothelial cells. J. Clin. Invest. 65 (6), 1351-1364 (1980).
- DeQuach, J. A., et al. Simple and high yielding method for preparing tissue specific extracellular matrix coatings for cell culture. PloS One. 5 (9), e13039 (2010).
- Sellers, J. R., Cook, S., Goldmacher, V. S. A cytotoxicity assay utilizing a fluorescent dye that determines accurate surviving fractions of cells. J. Immunol. Methods. 172 (2), 255-264 (1994).
- Van Veen, H. W., et al. Generation of a proton motive force by the excretion of metal-phosphate in the polyphosphate-accumulating Acinetobacter johnsonii strain 210A. J. Biol. Chem. 269 (47), 29509-29514 (1994).
- Jackson, V. N., Halestrap, A. P. The kinetics, substrate, and inhibitor specificity of the monocarboxylate (lactate) transporter of rat liver cells determined using the fluorescent intracellular pH indicator, 2′,7′-bis(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein. J. Biol. Chem. 271 (2), 861-868 (1996).
- He, J., et al. Role of Porphyromonas gingivalis FeoB2 in metal uptake and oxidative stress protection. Infect. Immun. 74 (7), 4214-4223 (2006).
- Anaya-Bergman, C., et al. Porphyromonas gingivalis ferrous iron transporter FeoB1 influences sensitivity to oxidative stress. Infect. Immun. 78 (2), 688-696 (2010).
- Ueshima, J., et al. Purification, gene cloning, gene expression, and mutants of Dps from the obligate anaerobe Porphyromonas gingivalis. Infect. Immun. 71 (3), 1170-1178 (2003).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. JoVE. (79), (2013).
- Cordes, T., Maiser, A., Steinhauer, C., Schermelleh, L., Tinnefeld, P. Mechanisms and advancement of antifading agents for fluorescence microscopy and single-molecule spectroscopy. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (14), 6699-6709 (2011).
- Pawley, J. . Handbook of biological confocal microscopy. , (2010).
- Gursoy, U., Könönen, E., Uitto, V. Prevotella intermedia ATCC 25611 targets host cell lamellipodia in epithelial cell adhesion and invasion. Oral Microbiol. Immunol. 24 (4), 304-309 (2009).
- Sengupta, D., et al. Interaction of Prevotella intermedia strain 17 leucine-rich repeat domain protein AdpF with eukaryotic cells promotes bacterial internalization. Infect. Immun. 82 (6), 2637-2648 (2014).
- Reyes, L., Herrera, D., Kozarov, E., Roldán, S., Progulske-Fox, A. Periodontal bacterial invasion and infection: contribution to atherosclerotic pathology. J. Clin. Periodontol. 40, S30-S50 (2013).
- Grant, M. M., et al. Oxygen tension modulates the cytokine response of oral epithelium to periodontal bacteria. J. Clin. Periodontol. 37 (12), 1039-1048 (2010).
- Biedermann, A., Kriebel, K., Kreikemeyer, B., Lang, H. Interactions of Anaerobic Bacteria with Dental Stem Cells: An In Vitro Study. PloS One. 9 (11), e110616 (2014).
- Kriebel, K., Biedermann, A., Kreikemeyer, B., Lang, H. Anaerobic Co-Culture of Mesenchymal Stem Cells and Anaerobic Pathogens-A New In Vitro Model System. PloS One. 8 (11), e78226 (2013).
- Peyyala, R., Kirakodu, S. S., Novak, K. F., Ebersole, J. L. Oral microbial biofilm stimulation of epithelial cell responses. Cytokine. 58 (1), 65-72 (2012).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gòmez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosens Bioelectro. 63, 218-231 (2015).
- Iyer, D., et al. AdpC is a Prevotella intermedia 17 leucine-rich repeat internalin-like protein. Infect. Immun. 78 (6), 2385-2396 (2010).
