Porphyromonas gingivalis som modellorganisme for Assessing Interaksjon av anaerobe bakterier med vertsceller

Summary

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Abstract

Anaerobe bakterier langt flere enn aerobe i mange menneskelige nisjer som tarmen, munn og vagina. Videre anaerobe infeksjoner er vanlige og ofte av urbefolkningen. Evnen til noen anaerobe patogener til å invadere menneskeceller gir dem adaptive tiltak for å unnslippe medfødt immunitet så vel som å modulere vertscelle oppførsel. Imidlertid, slik at de anaerobe bakterier som er aktive i løpet av eksperimentell undersøkelse av de hendelser kan by på utfordringer. Porphyromonas gingivalis, en Gram-negative anaerobe, er i stand til å invadere en rekke eukaryote ikke-fagocyttiske celler. Denne artikkelen beskriver hvordan du lykkes kultur og vurdere muligheten for P. gingivalis til å invadere menneske umbilikalvene endotelceller (HUVECs). To protokoller ble utviklet: en for å måle bakterier som med hell kan invadere og overleve i verten, og den andre for å visualisere bakterier i samspill med vertsceller. Disse teknikkene nødvendiggjøre bruk av en anaeRobic kammer å levere P. gingivalis med et anaerobt miljø for optimal vekst.

Den første protokollen er basert på den antibiotiske beskyttelsesbestemmelse, som i stor grad benyttes for å studere invasjon av vertsceller av bakterier. Imidlertid er det antibiotiske beskyttelsesbestemmelse begrenset; bare intracellulære bakterier som er dyrkbare etter behandling med antibiotika og vertscellelyse blir målt. For å vurdere alle bakterier i samspill med vertsceller, både levende og døde, har vi utviklet en protokoll som bruker fluorescerende mikroskopi for å undersøke host-patogen interaksjon. Bakterier blir fluorescensmerket med 2 ', 7'-bis (2-karboksyetyl) -5- (og-6) -carboxyfluorescein acetoksymetylester (BCECF-AM) og anvendt for å infisere eukaryote celler under anaerobe betingelser. Etter fiksering med paraformaldehyd og permeabilization med 0,2% Triton X-100, blir vertsceller merket med TRITC phalloidin og DAPI å merke celle cytoskjelettet og kjernen, henholdsvis. Multiple imaGES tatt på ulike knutepunkter (Z-stack) anskaffes for temporal-romlig visualisering av bakterier. Metoder brukt i denne studien kan anvendes på enhver dyrkbar anaerob og en hvilken som helst eukaryot celle type.

Introduction

Anaerobe bakterier kolonisere nesten alle overflater av det menneskelige legeme. Selv dominerende i floraen av tarm og urin traktater hvor oksygenkonsentrasjonen er lav, de også eksisterer på et høyt nivå på huden, munn, nese og svelg ^en. Anaerobe bakterier er en vanlig årsak til endogene infeksjoner og er ofte isolert fra syke områder. Men på grunn av sin natur kresen, kan anaerober være vanskelig å isolere og kultur. Studier med anaerobe bakterier må gjøres under spesielle forhold. Moderne anaerob-kultur teknikker tillate forskere å etterligne de anaerobe innstillingene som kreves for å studere mange anaerob laboratoriestammer eller kliniske isolater ^2,3.

Patogene anaerobe bakterier har utviklet et dynamisk forhold og co-evolusjon med vertscellene der de bor. De fleste anaerobe er utsatt for å drepe av vertens immunrespons før de når infectilige nivåer. Imidlertid har enkelte sykdomsfremkallende bakterier utviklet mekanismer for å flykte fra eller undergrave vertens immunrespons. De oppnår dette målet gjennom mekanismer som for eksempel unndragelse av immun anerkjennelse, nøytralisering av immun meklere, endring av celle-mediert immunitet, invasjon av vertsceller, og endring av immunsignale ^4. Porphyromonas gingivalis, en Gram-negative anaerobe innblandet i både muntlig og ekstra- sykdommer, er et eksempel på et sterkt innrettet bakteriell patogen stand til å forårsake patogene forandringer i verten ^5-7.

Lommer av biofilm plakk påløpt i dype sprekker dannet mellom tennene og tannkjøttet slimhinnevev kan havnen anaerobe bakterier som er beskyttet mot atmosfærisk oksygen ^8. Disse lommer tjener som en nisje for forskjellige anaerobe patogener, som for eksempel P. gingivalis ^9. P. gingivalis er en hjørnestein patogen som er i stand til oppussinging munn mikrobielle samfunn på en måte som fremmer utvikling og progresjon av periodontale sykdommer ^10. Den produserer et stort antall virulensfaktorer som er aktive mot et bredt spekter av verts proteiner og gir mekanismer for unndragelse av vertens forsvar ^11. Det er også i stand til å invadere epitel, endoteliale, fibroblastiske, og periodontale ligamentceller in vitro og in vivo ^{12 til 14 15.} Ved effektivt å invadere vertsceller, P. gingivalis kan unnslippe vert immunitet. Effektiv invasjon av vertsceller som ikke bare gjør det mulig for bakterien å unnslippe vertens forsvar, men også tjener som et reservoar for senere re-infeksjon så vel som endrer vertscellen. Studier av de molekylære mekanismene som er involvert i adhesjon og internalisering av bakterien ved vertsceller er nødvendig. Forskning i flere laboratorier er fokusert på å forstå de molekylære hendelser assosiert med internalisering av P. gingivalis av vertscelleneså vel som de mekanismer som brukes til å undertrykke og kapre immunresponsen og overleve de fiendtlige vertens forsvarsmekanismer.

Det er mange analyser som kan identifisere og karakterisere patogener som er i stand til å invadere vertsceller. Men in vitro studier med anaerobe patogener utgjøre mange eksperimentelle problemer for forskeren hovedsakelig fordi det er vanskelig å utføre studier som er avhengige av store instrumenter i fravær av oksygen. Dette blir forsterket av det faktum at eukaryote celler krever oksygen for å vokse, og må derfor fremstilles separat i vevskultur inkubatorer. En måte å unngå slike hindringer ville være å utføre studiene under atmosfærisk oksygen, men som ville gjøre veksten av anaerobe bakterier umulig. En annen metode ville være å bruke varmedrepte bakterier til å infisere og studere vert-celle-interaksjoner. Men forskjeller mellom varmedrepte og levedyktige bakterier som reduserer relevansen av host-patogen interactipå ^16. Det er sentralt å studere levedyktige bakterier med uendret uttrykk i samspill med vertsceller; derfor, metoder for dyrkning av P. gingivalis i et anaerobt miljø er angitt. Dessuten er to enkle, kostnadseffektive protokoller vist for å vurdere evnen til P. gingivalis å bli internalisert av menneske navleveneendotel celler (HUVECs). Den første protokollen er basert på den populære antibiotika beskyttelsesbestemmelse. Selv om analysen er enkel, er betraktninger ved bruk av anaerobe mikroorganismer er gitt. Den andre protokollen krever bruk av en fluorescerende mikroskop for å visualisere og kommunisere internalisert P. gingivalis. Hver analyse har sine begrensninger og fordeler som vil bli diskutert å gi forskeren en disposisjon for å studere invasivitet av anaerobe bakterier. Selv om den nåværende manuskriptet studerer P. gingivalis og HUVECs, kan disse protokollene brukes til mange andre anaerobe bakterier, så velsom for andre typer av vertsceller.

Protocol

De følgende protokoller beskriver metoder for dyrkning og studere invasjonen av anaerobe arter, P. gingivalis; Imidlertid kan disse protokoller benyttes for et antall av anaerobe patogener. Selv HUVECs anvendes, kan denne protokoll brukes til andre eukaryote celler både immune og ikke-immune. 1. Anaerob Chamber bruk og vedlikehold Merk: P. gingivalis er en anaerob følsom for normale nivåer av oksygen møtt i luften. En kontrollert anaerob milj…

Representative Results

Protokoller som er skissert ovenfor ble brukt i å studere vert-patogen interaksjon mellom P. gingivalis og endotelceller. P. gingivalis W83 og P. gingivalis V3150 bærer en sletting av PG0228 ble brukt i studien. Den PG0228 er forutsagt å kode for et protein som kan endre nivåene av RNA og proteiner, og som kan påvirke interaksjonen av P. gingivalis med vertsceller. For å undersøke effekten av PG0228 på P. gingivalis 's evne til å kommunisere med vertsceller, ble …

Discussion

Alle de ovennevnte metoder kan brukes til å konstruere spesifikke analyser for å evaluere interaksjonen av anaerobe bakterier med eukaryote celler. Imidlertid er det flere hensyn å kunne utføre forsøkene. Først er de mikrobielle stammer som kan benyttes i en studie.

Det er avgjørende for sammenligning av to stammer med både overlevelse analysen, så vel som ved mikroskopi-analyse at de er på lignende vekstfaser og oppnå liknende cellekonsentrasjoner som eventuelle forskjeller i de …

Materials

Vinyl Anaerobic Chamber-Type B	Coy Laboratory Products		Model 2000 incubator
TSA II Trypticase Soy Agar w/5% Sheep Blood	BBL	221261
Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool	LifeLine Technology	FC-0044
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	LifeLine Technology	LL-0003
TrypKit	LifeLine	LL-0013
Saponin	Riedel-de Haen	16109
Gentamicin Sulfate Salt	Sigma-Aldrich	G-1264
Metronidazole	Sigma-Aldrich	M-3761
BCECF-AM	LifeTechnologies	B1150
TRITC Phalloidin	Sigma-Aldrich	P1951
18 mm Circular Coverslips	Electron Microscopy Sciences	72222-01
VectaShield Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200