Porphyromonas gingivalis som modellorganism för att bedöma Interaktion av anaeroba bakterier med värdceller

Summary

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Abstract

Anaeroba bakterier långt fler än aerober i många humana nischer såsom tarmen, mun och vagina. Dessutom anaeroba infektioner är vanliga och ofta av inhemskt ursprung. Förmågan hos vissa anaeroba patogener att invadera humana celler ger dem anpassningsåtgärder att fly medfödd immunitet samt att modulera värdcellbeteende. Men se till att anaeroba bakterier är levande under experimentell utredning av händelserna kan utgöra utmaningar. Porphyromonas gingivalis, en gramnegativ anaerob, är i stånd att invadera en mängd olika eukaryota icke-fagocytiska celler. Den här artikeln beskriver hur man framgångsrikt kultur och bedöma förmågan hos P. gingivalis att invadera humana navelvenendotelceller (HUVEC). Två protokoll utvecklades: ett för att mäta bakterier som framgångsrikt kan invadera och överleva i värden, och den andra för att visualisera bakterier interagerar med värdceller. Dessa tekniker nödvändiggör användningen av en AnaeRobic kammare att leverera P. gingivalis med en anaerob miljö för optimal tillväxt.

Det första protokollet är baserat på den antibiotiska skyddsanalys, som till stor del används för att studera invasion av värdceller av bakterier. Emellertid är antibiotikumet skyddsanalysen begränsad; endast intracellulära bakterier som är odlingsbara efter antibiotikabehandling och värdcell lys mäts. För att bedöma alla bakterier interagerar med värdceller, både levande och döda, har vi utvecklat ett protokoll som använder fluorescerande mikroskopi för att undersöka värdpatogen interaktion. Bakterier fluorescent märkt med 2 ', 7'-bis- (2-karboxietyl) -5- (och-6) -karboxifluorescein acetoximetylester (BCECF-AM) och användes för att infektera eukaryotiska celler under anaeroba förhållanden. Efter fixering med paraformaldehyd och permeabilisering med 0,2% Triton X-100, är ​​värdceller märktes med TRITC falloidin och DAPI att märka cell cytoskelettet och kärnan, respektive. Multipel imaGES tagna vid olika fokuspunkter (Z-stack) erhålls för temporal-spatial visualisering av bakterier. Metoder som används i denna studie kan tillämpas på alla odlingsbara anaerob och vilken eukaryot celltyp.

Introduction

Anaeroba bakterier koloniserar nästan alla ytor av människokroppen. Även dominerar i floran av tarm och urogenitala regionerna där syrehalterna är låga, de finns också på höga nivåer på huden, mun, näsa och hals ^1. Anaeroba bakterier är en vanlig orsak till endogena infektioner och ofta isolerade från sjuka ställen. Emellertid på grund av sin kräsna natur kan anaerober vara svårt att isolera och kultur. Studier med anaeroba bakterier måste göras på begränsade villkor. Moderna anaerob-odlingstekniker tillåter forskare att efterlikna de anaeroba inställningar som krävs för att studera många anaeroba laboratoriestammar eller ens kliniska isolat ^2,3.

Patogena anaeroba bakterier har utvecklat en dynamisk relation och co-evolution med värdcellerna där de är bosatta. De flesta anaerober är mottagliga för avlivning av värdimmunsvar innan infectigare nivåer. Men vissa patogena bakterier utvecklat mekanismer för att fly från eller undergräva värdens immunsvar. De uppnå detta mål genom mekanismer som undvikande av immunigenkänning, neutralisering av immunmediatorer, förändring av cellmedierad immunitet, invasion av värdceller, och ändring av immun signalering ^4. Porphyromonas gingivalis, en gramnegativ anaerob inblandad i både tal och extraorala sjukdomar, är ett exempel på en mycket anpassad bakteriell patogen som kan orsaka patogena förändringar i värden ^5-7.

Fickor av biofilm plack upplupna i djupa sprickor bildas mellan tänderna och tandkötts slemhinnevävnaden kan hysa anaeroba bakterier som är skyddade från atmosfäriskt syre ^8. Dessa tandköttsfickor fungera som en nisch för olika anaeroba patogener, såsom P. gingivalis ^9. P. gingivalis är en keystone-patogen som är i stånd att ombyggnadsing den orala mikrobiella på ett sätt som främjar utvecklingen och utvecklingen av parodontala sjukdomar ^10. Den producerar ett stort antal virulensfaktorer som är aktiva mot ett brett spektrum av värdproteiner och innehåller mekanismer för försvårande av värdförsvar ^11. Det är också i stånd att invadera epitel-, endotel-, fibroblastiska, och parodontala ligamentceller in vitro ^12-14 och in vivo ^15. Genom att effektivt invadera värdceller, P. gingivalis kan undkomma värdimmunitet. Effektiv invasion av värdceller inte bara gör det möjligt för bakterien att undkomma värdförsvar, men också fungerar som en reservoar för framtida återinfektion samt förändrar värdcellen. Det krävs Studier av de molekylära mekanismer som är involverade i vidhäftning och internalisering av bakterien av värdceller. Forskning inom flera laboratorier är inriktad på att förstå de molekylära händelser i samband med internalisering av P. gingivalis av värdcellernaliksom de mekanismer som används för att undertrycka och kapa immunsvaret och överleva de fientliga värdens försvarsmekanismer.

Det finns många analyser som kan identifiera och karakterisera patogener som har förmåga att invadera värdceller. Men studier med anaeroba patogener in vitro utgör många experimentella problem för forskaren främst eftersom det är svårt att genomföra studier som förlitar sig på skrymmande instrument i frånvaro av syre. Detta förvärras av det faktum att eukaryota celler kräver syre för att växa och därmed måste framställas separat i vävnadskultur inkubatorer. Ett sätt att undvika sådana hinder skulle vara att utföra de studier under atmosfärs syre, men som skulle göra tillväxten av anaeroba bakterier omöjligt. En annan metod skulle vara att använda värmeavdödade bakterier att infektera och studera värd-cell-interaktioner. Det finns dock skillnader mellan värmeavdödade och livskraftiga bakterier som minskar relevansen av värdpatogen interactipå ^16. Det är centralt att studera livskraftiga bakterier med oförändrad uttryck interagerar med värdceller; därför, metoder för odling av P. gingivalis i en anaerob miljö ges. Dessutom är två enkla kostnadseffektiva protokoll visat för att bedöma förmågan hos P. gingivalis att internaliseras av mänskliga navelvenendotelceller (HUVEC). Det första protokollet är baserad på den populära antibiotikaskyddsanalys. Även om analysen är enkel, är överväganden vid användning av anaeroba mikroorganismer ges. Det andra protokollet kräver användning av en fluorescerande svepmikroskop för att visualisera interagera och internaliserad P. gingivalis. Varje analys har sina begränsningar och fördelar som kommer att diskuteras för att förse forskaren en kontur för att studera invasivitet av anaeroba bakterier. Även om den nuvarande manuskriptet studerar P. gingivalis och HUVEC, kan dessa protokoll användas för många andra anaeroba bakterier samtsom för andra typer av värdceller.

Protocol

Följande protokoll beskriver metoder för odling och studera invasion av anaeroba arter, P. gingivalis; emellertid kan dessa protokoll användas för ett antal anaeroba patogener. Även HUVECs används, kan detta protokoll användas för andra eukaryota celler både immuna och icke-immuna. 1. anaerob kammare Användning och underhåll Obs: P. gingivalis är en anaerob känslig för normala nivåer av syre förekommer i luften. En kontrollerad ana…

Representative Results

Protokoll som beskrivs ovan användes för att studera värdpatogen interaktion mellan P. gingivalis och endotelceller. P. gingivalis W83 och en P. gingivalis V3150 som bär en deletion av PG0228 användes i studien. Den PG0228 förutspås koda för ett protein som kan förändra nivåerna av RNA och proteiner, vilket i slutändan kan påverka interaktionen av P. gingivalis med värdceller. För att undersöka effekten av PG0228 på P. gingivalis förmåga att interagera med …

Discussion

Alla ovan nämnda metoder kan användas för att utforma specifika analyser för att bedöma samverkan av anaeroba bakterier med eukaryota celler. Det finns dock flera faktorer för att framgångsrikt utföra experimenten. Först är de mikrobiella stammar som kan användas i en studie.

Det är viktigt i en jämförelse mellan två stammar med både överlevnadsanalys samt genom mikroskopi analys att de är likartade tillväxtfaser och uppnå liknande cellkoncentrationer som eventuella skill…

Materials

Vinyl Anaerobic Chamber-Type B	Coy Laboratory Products		Model 2000 incubator
TSA II Trypticase Soy Agar w/5% Sheep Blood	BBL	221261
Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool	LifeLine Technology	FC-0044
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	LifeLine Technology	LL-0003
TrypKit	LifeLine	LL-0013
Saponin	Riedel-de Haen	16109
Gentamicin Sulfate Salt	Sigma-Aldrich	G-1264
Metronidazole	Sigma-Aldrich	M-3761
BCECF-AM	LifeTechnologies	B1150
TRITC Phalloidin	Sigma-Aldrich	P1951
18 mm Circular Coverslips	Electron Microscopy Sciences	72222-01
VectaShield Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200