Een Cancer Cell Sferoïde Assay om Invasion beoordelen in een 3D-instelling
Summary
This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.
Abstract
The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.
Introduction
Er is vastgesteld dat de kankercel beweeglijkheid is voorspellend voor metastatische potentieel, gezien het feit dat dergelijk gedrag vergemakkelijkt invasie door het basaal membraan en de toegang tot de bloedsomloop 1. Het meeste onderzoek op motiliteit is gericht op hoe cellen gedragen in een tweedimensionale omgeving (2D), maar het wordt algemeen erkend dat de beweging van cellen in een driedimensionale (3D) matrix representatiever hoe deze zelfde cellen ook daadwerkelijk gedragen in vivo 2. 3D-cultuur systemen worden steeds meer gebruikt om cellulaire gedragingen die variëren van cel morfologie, om de groei kinetiek en drugs gevoeligheid 3 bestuderen. De wens om te controleren kankercel invasie in het kader van een 3D milieu heeft geleid tot de synthese van de eerder vastgestelde technieken waarbij het genereren van 3D celaggregaten (sferoïden) via de hangende druppel kweekmethode 4, gevolgd door het inbedden van deze bolletjes in een 3D extracellulair matrix (ECM), bestaande uit collageen en basaal membraan materialen 5. Deze methode beoogt een verbetering van de eerder bestaande technieken door een gestroomlijnde benadering die gemakkelijk kan worden gebruikt voor invasie vergelijken onder verschillende experimentele omstandigheden.
Meer traditionele manieren om celbeweeglijkheid beoordelen in vitro zijn de scratch wond test en de transwell assay 6. Eerstgenoemde assay toont celbeweeglijkheid in een 2D omgeving en dus onafhankelijk van een verscheidenheid aan functies essentieel voor in vivo invasie, bijvoorbeeld protease-activiteit 7. De transwell test kan beter model celinvasie wanneer de put inzetstukken bekleed met ECM substraten, maar slechts één parameter, namelijk het verschijnen van cellen op de tegenoverliggende membraanoppervlak wordt gemeten, en veel nuances van celinvasie dus niet gemakkelijk waarneembare. In tegenstelling tot deze technieken de kankercel sferoïde invasie assay (figuur 1 </ strong>) maakt het real-time monitoring van celinvasie in een omgeving die niet alleen fysiologisch relevant, maar maakt ook belangrijk cellijn-specifieke functies worden gevisualiseerd, zoals individuele versus collectieve celmigratie 8. Deze methode biedt ook voordelen ten opzichte van standaard 3D groei cultuur assays. De generatie van cellulaire aggregaten via de opknoping neerzetten aanvankelijk dwingt cel beweging, zodat de cellen worden gestimuleerd om binnen te vallen nadat deze beperking is opgeheven. Bovendien, zodra deze beperking is opgeheven, zal cel uitgang overgaan in een uniforme richting die dan gemakkelijk kan worden gekwantificeerd.
De meest populaire ECM materialen voor kankercel sferoïden assays Matrigel en type I collageen, waarbij elk van deze componenten heeft belangrijke en duidelijke rol bij het beïnvloeden metastatisch gedrag. Matrigel is een afgescheiden mengsel van eiwitten geproduceerd door Engelbreth-Holm Swarm muizen sarcoma-cellen en is verrijkt in basement membraaneiwitten zoals laminine, entactine, en collageen type IV 9. Daarom Matrigel wordt voortaan aangeduid als "basale membraan materiaal." Deze basaalmembraan materialen essentiële liganden die nodig zijn voor integrine adhesie tijdens kankercel invasie 10 naast vele andere eiwitten die een reeks effecten uitoefenen op celgedrag 11. In vergelijking, type I collageen, gewoonlijk bereid uit zuur digesties van pezen en andere dichte collagene structuren 12, is een veel eenvoudigere matrixmateriaal dat dient als een belangrijk structureel element van het bindweefsel stroma en ondersteunende weefsels en organen van het lichaam. Het is aangetoond dat de fysische eigenschappen van collageen een aantal kenmerken van celmotiliteit kan reguleren; bijvoorbeeld de aanpassing van de collageenvezels in het tumor-stroma-interface maakt kankercellen vervolgens migreren langs de fibrillen bij invasie in de stroma 13. In de test hier gepresenteerde zowel type I collageen en basaalmembraan materialen worden gebruikt als instrumenten om 3D kankercel-stroma interacties te bestuderen.
Het effect van remming of stimulatie van paden die bepalen invasie kunnen worden gecontroleerd nadat de cellen zijn ingebed in de 3D-matrix. Cellen kunnen worden voorbehandeld tijdens de groei in de hangende druppels of bij overdracht naar de 3D-kweek, afhankelijk of een langdurige behandeling vereist invasie moduleren. Voor kortere behandelingen, wordt aanbevolen dat het geneesmiddel wordt gemengd met de suspensie sferoïde na het verzamelen en de media die rond de 3D culturen adequate blootstelling aan het geneesmiddel aan de cellen te vergemakkelijken. Vervolgens kan normaal of tumorgeassocieerde stromale cellen worden gemengd met het matrixmateriaal om hun rol bij het moduleren van tumorcel invasie te evalueren of te bepalen hoe paracriene en autocriene signalering invloeden celgedrag. Dit idee werd aangetoond in een studie waarin de co-cultuur van de colop kanker en endotheelcellen in opknoping daalt tot een vasculaire netwerk binnen de sferoïden 14. Tenslotte kan de ECM bestanddelen worden veranderd, zoals kankercel invasie wordt beïnvloed door verschillende substraten 15. Werkwijze Onderstaande zal dus een kader voor de beoordeling kankercel invasie onder verschillende omstandigheden. In het algemeen werd gevonden dat niet alle cellijnen sferoïden creëren in de opknoping druppels en-epitheliale uit cellijnen meestal regelmatige bollen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze studie evalueerde de uitvoering van een paneel van kankercellijnen in een sferoïde invasie assay (Tabel 1). In het algemeen vinden we dat bolvormige formatie wordt versterkt in de meer-epitheliale uit cellijnen, waarbij de aanwezigheid van cel-cel contacten bevordert de vorming van een sferoïde-achtige architectuur. Bekende cellijnen die een epitheliale-mesenchymale overgang hebben ondergaan, zoals MDA-MB-231-cellen niet sferoïden in de hangende druppel cultuur waarschijnlijk vormen vanwege hun …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ondersteund door NIH subsidies P30 CA051008 en T32 CA009686 (ATR).
Materials
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | CB-40234 | |
| Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg | Millipore | 08-115 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| 100mm TC-treated Dishes | Corning Incorporated | 430167 | |
| 24-well TC-treated Plates | NEST Biotechnlology | 702001 | |
| Olympus IX-71 Inverted Microscope | |||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and LNCaP cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. | |||
References
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Metastasis: Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev. Cancer. 2 (8), (2002).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J Cell Sci. 116 (12), 2377-2388 (2003).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), (2007).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. 51, (2011).
- Del Duca, ., Werbowetski, D., T, ., Del Maestro, R., F, Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. J Neuro-Oncol. 67 (3), (2004).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J Vis Exp. 88, (2014).
- Ramos-DeSimone, N., Hahn-Dantona, E., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. Activation of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) via a converging plasmin/stromelysin-1 cascade enhances tumor cell invasion. J Bio Chem. 274 (19), .
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
- Shaw, L. M., Chao, C., Wewer, U. M., Mercurio, A. M. Function of the integrin α6β1 in metastatic breast carcinoma cells assessed by expression of a dominant-negative receptor. Cancer Res. 56 (5), 959-963 (1996).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), (2010).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), (2006).
- Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Campbell, J. M. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), (2006).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol Med. 140, 141-151 (2007).
- Brenner, W., Groß, S., Steinbach, F., Horn, S., Hohenfellner, R., Thüroff, J. W. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Lett. 155, 199-205 (2000).
- Nieman, M. T., Prudoff, R. S., Johnson, K. R., Wheelock, M. J. N-cadherin promotes motility in human breast cancer cells regardless of their E-cadherin expression. J Cell Biol. 147 (3), .
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), (2013).
- Sodek, K. L., Brown, T. J., Ringuette, M. J. Collagen I but not Matrigel matrices provide an MMP-dependent barrier to ovarian cancer cell penetration. BMC Cancer. 8 (1), 223-2210 (2008).
- Nguyen-Ngoc, K. V., Ewald, A. J. Mammary ductal elongation and myoepithelial migration are regulated by the composition of the extracellular matrix. J Microsc. 251 (3), 212-223 (2013).
- Glinskii, A. B., Smith, B. A., Jiang, P., Li, X., Yang, M., Hoffman, R. M., Glinsky, G. V. Viable circulating metastatic cells produced in orthotopic but not ectopic prostate cancer models. Cancer Res. 63 (14), 4239-4243 (2003).
