암 세포 회전 타원체 분석은 3D 설정에 침략을 평가하기 위해
Summary
This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.
Abstract
The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.
Introduction
그것은 암 세포의 운동성이 같은 행동이 순환 시스템 1에 기저막과 항목을 통해 침입을 용이하게 주어진, 전이 가능성의 예측이라고 설정됩니다. 운동성에 가장 연구가 광범위하게 3 차원 매트릭스에서 세포의 이동 것 실제로 방법이 동일 세포보다 대표 인 것으로 인식되고있다하더라도 세포가, 2 차원 (2D) 환경에서 동작하는 방법에 초점을 맞추었다 생체 2에서 작동합니다. 3 차원 배양 시스템은 점차 성장 역학 및 약물 감수성 3, 세포 형태의 범위 셀룰러 동작을 연구하기 위해 사용된다. 3 차원 환경의 컨텍스트 내에서 암 세포 침입을 모니터링하는 욕구는 3 차원 세포 내로 이러한 타원체 매립 하였다 매달려 드롭 배양법 (4)를 통해 3 차원 세포 집합체 (타원체)의 생성을 포함하는 이전에 확립 된 기술을 합성하게되었다 매트릭스 (ECM) 콜라겐과 기저막 재료 (5)으로 구성. 이 방법은 쉽게 실험 다양한 조건 하에서 내습과 비교하기 위해 이용 될 수있는 간소화 된 방법을 제공함으로써 이전에 확립 된 기술을 개선하고자한다.
체외에서 세포 운동성을 평가하는 전통적인 방법은 스크래치 상처 분석 및 트랜스 웰 분석 (6)이다. 전 분석은 2 차원 환경에서 세포 운동성을 도시 한 생체 침입에 중요한 다양한 기능, 예를 들면 프로테아제 활성 7 그러므로 독립적이다. 트랜스 웰 분석은 웰 인서트가 대향 막 표면에 세포의 모양, 즉 ECM 기재하지만, 단 하나의 파라미터를 더 모델 세포 침윤 코팅 할 수있을 때를 측정하고, 세포 침윤의 많은 뉘앙스 따라서 용이하게 관찰 할 수없는된다. 이러한 기술, 암세포 침윤 타원체 분석 (도 1 <대조적/ 강해>) 만 생리 관련이없는 환경에서 세포 침윤의 실시간 모니터링을 허용하지만, 또한 이러한 집단 대 개인 세포 이동 8로서 가시화 될 중요한 세포주 특정 기능을 허용한다. 이 방법은 표준 3 차원 배양 성장 분석보다 이점을 제공한다. 세포는 이러한 제한이 해제 된 후 침입하는 인센티브되도록 매달려 드롭 방법을 통해 세포 응집체의 생성은 처음에 세포의 움직임을 제한한다. 그 제약 조건이 해제되면 또한, 세포 출구는 편리하게 정량 할 수있는 일정한 방향으로 진행됩니다.
암세포 타원체 분석법에 가장 널리 사용되는 재료는 ECM의 Matrigel하고 이러한 구성 요소들의 각각은 전이 거동에 영향을 미치는 중요한 역할과 구별 갖는 경우 타입 I 콜라겐. 마트 리겔은 Engelbreth-Holm이 운집 마우스 육종 세포에 의해 생산 된 단백질의 분비 혼합물이며, baseme에 충실이러한 라미닌, entactin 및 제 4 형 콜라겐 (9)와 같은 NT를 막 단백질. 이 때문에 마트 리겔은 이제부터라고 "기저막 물질."이 기저막 물질은 세포의 행동 (11) 상에 다양한 효과를 발휘하는 다른 많은 단백질 외에 암세포 침윤 (10) 중 접착 인테그린에 필요한 필수적인 리간드를 제공한다. 비교하면, 일반적으로 힘줄 등 치밀한 콜라겐 구조 (12)의 산으로부터 제조 다이제스트 I 형 콜라겐은, 본체의 결합 조직과 기질지지 조직과 기관의 주요 구조적 요소로서 기능 훨씬 단순 매트릭스 물질이다. 이것은 콜라겐의 물리적 특성은 세포 운동성의 기능의 수를 조절할 수 있음을 입증되었다; 예를 들어, 종양 – 기질 계면에서 콜라겐 섬유의 배향은 기질 (13)에 침입 할 때 그 다음에 피 브릴을 따라 이동하는 암세포를 허용. 여기에 제시된 분석에서는 두 종류의 난 콜라겐과 기저막 재료는 3D 암 세포 – 기질 상호 작용을 연구하는 도구로 사용된다.
세포를 3 차원 매트릭스에 매립 한 후 침입이 모니터링 될 수 제어 경로의 억제 또는 자극의 효과. 세포 매달려 방울 또는 긴 치료가 침공을 조절해야합니다 여부에 따라 3D 문화로 전송시 성장하는 동안 전처리 할 수 있습니다. 짧은 치료를 들어, 약물이 컬렉션 후 타원체 서스펜션뿐만 아니라 셀에 충분한 약물 노출을 용이하게하기 위해, 3 차원 배양을 둘러싸 매체와 혼합하는 것을 추천합니다. 다음에, 정상 또는 종양 – 관련 기질 세포는 종양 세포의 침윤을 변조에서의 역할을 평가하는 방법 또는자가 분비 및 주변 분비 신호의 영향 세포 행동 결정하는 매트릭스 물질과 혼합 될 수있다. 이 아이디어는 연구에 나타내었다 곳 (COL)의 공 배양암 매달려 방울의 내피 세포에 회전 타원체 (14) 내의 혈관 네트워크되었다. 암세포 침윤이 다른 기판 (15)에 의해 영향을 마지막으로, ECM 성분은 또한 변경 될 수있다. 아래에 제시된 방법에 따라서 다양한 조건 하에서 암 세포의 침윤을 평가하기위한 프레임 워크를 제공한다. 일반적으로 모든 세포주가 걸려 방울에 타원체를 생성하고 상피 보이는 세포주는 일반적으로 일반 구를 형성하지 않는 것이 발견되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 연구는 회전 타원체 침윤 분석 (표 1) 암 세포주 패널의 성능을 평가 하였다. 일반적으로, 우리는 회전 타원체 형성 세포 간 접합이 존재 타원체 형상 구조의 형성을 촉진 더 상피 생긴 세포주에서 향상되는 것을 발견한다. MDA-MB-231 세포와 같은 상피 – 간엽 전환을받은 알려진 세포주, 그들의 감소 E-, N- 및 P-cadherin의 발현 16에 가장 가능성이 매달려 드롭 문화 타원체를 형성?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH 보조금 P30의 CA051008 및 CA009686 T32 (ATR)에 의해 지원됩니다.
Materials
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | CB-40234 | |
| Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg | Millipore | 08-115 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| 100mm TC-treated Dishes | Corning Incorporated | 430167 | |
| 24-well TC-treated Plates | NEST Biotechnlology | 702001 | |
| Olympus IX-71 Inverted Microscope | |||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and LNCaP cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. | |||
References
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