3Dの設定で侵略を評価するために、癌細胞スフェロイドアッセイ
Summary
This method evaluates cancer cell invasion from spheroids into a surrounding 3D matrix. Spheroids are generated via the hanging drop culture method and then embedded in a matrix comprised of basement membrane materials and type I collagen. Invasion out of the spheroids is subsequently monitored.
Abstract
The invasive nature of cancer cell lines is thought to correlate with their metastatic potential. Most traditional assays, however, do not examine these invasive features in a three-dimensional environment and the resulting data suffer from reduced biological applicability. Here an approach is presented to visualize the invasive ability of cell lines in a physiologically relevant setting. The cancer cell spheroid invasion assay first utilizes gravity to generate spheroids within drops of media that hang from the lid of a cell culture dish. Next, these spheroids are embedded in a 3D matrix consisting of a mixture of basement membrane materials and type I collagen. Cancer cell egression from the spheroids into the surrounding matrix is then monitored over time. The method described here can be modified to examine invasion after coculture of different cell types, inclusion of drugs/inhibitors, or alterations in extracellular matrix (ECM) constituents.
Introduction
これは、癌細胞の運動性がこのような行為は、基底膜および循環系1への参入を通じて侵入を促進することを考えると、転移の可能性を予測することが確立されています。運動に関するほとんどの研究は、それが広く、三次元（3D）マトリクスの細胞の動きがする実際にどのようにこれらの同じ細胞のより代表的であることが認識されてきているものの、細胞が、二次元（2D）の設定でどのように動作するかに焦点を当てています生体 2 で動作します。 3D培養システムは、ますます増殖動態および薬物感受性3に、細胞形態の範囲での細胞挙動を研究するために使用されます。 3D環境のコンテキスト内での癌細胞の浸潤をモニターするための欲求は、3Dの外に、これらのスフェロイドを埋め込 む続いハンギングドロップ培養法4を介して3D細胞凝集体（スフェロイド）の生成を含む、以前に確立された技術の合成につながっています行列（ECM）コラーゲンと基底膜材料5で構成される。この方法は、簡単な実験、種々の条件下で浸潤を比較するために利用することができる効率的なアプローチを提供することにより、これらの以前に確立された技術を改良することを目的とします。
in vitroで細胞の運動性を評価するためのより多くの伝統的な方法は、スクラッチ巻きアッセイおよびトランスウェルアッセイ6です。前者の分析は、2D設定で細胞の運動性を示し、したがって、in vivoでの侵略、 例えばプロテアーゼ活性 7のための重要な機能の様々な独立しています。トランスウェルアッセイは、より良いウェルインサートは、ECM基質でコーティングされたが、単一のパラメータのみ、反対側の膜表面上の細胞の出現、すなわちされたモデル細胞の浸潤を測定したり、細胞浸潤の多くのニュアンスは、このように容易に観察されません。これらの技術とは対照的に、癌細胞スフェロイド浸潤アッセイ（ 図1 </ strong>の）だけで、生理学的に関連しない設定に細胞浸潤のリアルタイム監視が可能になり、だけでなく、個々の対集団細胞遊走8として可視化されるべき重要な細胞株固有の機能を、許可します。この方法はまた、標準的な三次元培養増殖アッセイを超える利点を提供します。細胞は、この制約が解除された後に侵入する奨励されるように、ハンギングドロップ法を介した細胞凝集体の生成は、最初に、細胞運動を抑制します。その制約が解除された後さらに、細胞放出はその後便利に定量することができる一定の方向に進むことになります。
癌細胞スフェロイドのアッセイのために使用される最も人気のあるECM材料は、マトリゲルとこれらの各コンポーネントは、転移挙動に影響を与える上で重要と異なる役割を持っているI型コラーゲン、あります。マトリゲルは、エンゲルホルム、スウォームマウス肉腫細胞によって産生されるタンパク質の分泌混合物であり、かつbasemeに富みますラミニン、エンタクチン、およびIV型コラーゲンなどの9ヌクレオチド膜タンパク質。この理由のために、マトリゲルを今後とも呼ばれる「基底膜材料。」これらの基底膜材料を細胞の挙動11への影響の範囲を発揮する多くの他のタンパク質に加えて、癌細胞の浸潤10中インテグリン接着のために必要不可欠なリガンドを提供します。比較では、一般的に腱および他の高密度のコラーゲン構造物12の酸消化物から調製されたI型コラーゲンは、身体の組織および器官を支持する結合組織と間質の主要な構造要素として機能する非常に単純なマトリックス材料です。それは、コラーゲンの物理的特性は、細胞運動性の機能の数を調節することができることが実証されています。例えば、腫瘍間質界面におけるコラーゲン線維の整列は、基質13内に侵入したときに、その後、それらの線維に沿って移動するように癌細胞を許可します。ここで紹介するアッセイでは、両方のI型コラーゲンと基底膜の材料は、3Dがん細胞間質の相互作用を研究するためのツールとして利用されています。
細胞は三次元マトリックス中に埋め込まれた後の侵入を制御する経路の阻害または刺激の効果をモニターすることができます。細胞は、長い治療が侵入を調節するために必要とされるかどうかに応じて、ハンギングドロップまたは3D培養に移す際に、成長中に前処理することができます。短い治療のためには、薬物が収集後のスフェロイド懸濁物、ならびに細胞への適切な薬物暴露を容易にするために、3次元培養を取り囲む培地と混合することをお勧めします。次に、正常または腫瘍関連間質細胞は、腫瘍細胞浸潤の調節におけるそれらの役割を評価するために、またはどのように傍分泌および自己分泌シグナル伝達に影響を与える細胞の挙動を決定するために、マトリックス材料と混合することができます。このアイデアは、COLの共培養の研究で示されました懸滴中の癌細胞および内皮細胞上でスフェロイド14内の血管網につながりました。癌細胞の浸潤は、異なる基板15の影響を受けるように、最終的に、ECMの成分はまた、変更することができます。以下に示す方法は、このように様々な条件下での癌細胞の浸潤を評価するための枠組みを提供します。一般に、すべての細胞株は、ハンギングドロップでスフェロイドを作成し、上皮に見える細胞株は、典型的には、定期的な球を形成しないことが見出されました。
Protocol
Representative Results
Discussion
この研究では、スフェロイド浸潤アッセイ（ 表1）の癌細胞株のパネルの性能を評価しました。一般的に、我々はスフェロイド形成が細胞間結合の存在は、回転楕円体のような構造の形成を促進する複数の上皮に見える細胞株に増強されることを見つけます。 MDA-MB-231細胞のような上皮間葉移行を経験した既知の細胞系は、それらの減少E-、N-およびP-カドヘリン発現16に最…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIHの助成金のP30のCA051008とT32 CA009686（ATR）でサポートされています。
Materials
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | CB-40234 | |
| Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg | Millipore | 08-115 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| 100mm TC-treated Dishes | Corning Incorporated | 430167 | |
| 24-well TC-treated Plates | NEST Biotechnlology | 702001 | |
| Olympus IX-71 Inverted Microscope | |||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and LNCaP cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. | |||
References
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